Novos anticorpos anti-nucleolina para terapia anti-tumoral direcionada

Tese de doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, no ramo de Biotecnologia e Saúde, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de CoimbraCancer is nowadays the second leading cause of death and current therapeutic approaches still reveal ineffective in several cases. Therefore, there is a need to develop more efficacious therapeutic agents, especially for subtypes of cancer where targeted therapies are still missing, and, as such, unmet medical needs are evident. Limited drug penetration into tumors limits the efficacy of therapies targeting cancer cells. One of the strategies to overcome this problem is upon targeting the more accessible tumor vasculature. In this context, nucleolin arises as a target of extreme relevance, as it is overexpressed at the surface of cancer and angiogenic endothelial cells thus enabling a dual cellular targeting strategy. Antibodies have been extensively studied and some have been approved for the treatment of different types of tumors. Antibodies act by several mechanisms, from direct cell death to immune-mediated mechanisms (through the Fc region of the antibody). The latter include antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), which plays a central role in the clinical efficacy of some antibodies. However, the high molecular weight of these proteins (≈150 kDa) limits effective penetration in solid tumors. Therefore, smaller units for antigen recognition have been developed. Nanobodies or VHHs are the variable domains of the heavy chains from camelid antibodies that lack light chains, presenting small size (≈15 kDa), high affinity to their antigens and reduced immunogenicity in humans. In addition, they are also versatile platforms for the development of different antibody formats. The main aim of this project was to develop and characterize new nanobody-based antibody formats against nucleolin. These consisted of (i) nanobodies generated by a grafting strategy using a nucleolin-binding sequence and (ii) an anti-nucleolin nanobody- Fc antibody, aiming at exploring immune mechanisms, namely ADCC. In addition, this ii work aimed also at exploring the use of nanobodies as bispecific proteins, where nucleolin and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) were selected as models of target proteins. An anti-TNF-α VHH was used as a scaffold for grafting F3 peptide-derived nucleolin-binding sequences onto either complementarity determining region 1 (CDR1) or 3 (CDR3), the two most relevant antigen-binding regions. The grafted sequences consisted on a 10-amino acid sequence, with or without flanking linkers at each end, aiming at improving CDR flexibility. The generated nanobodies revealed binding to both purified nucleolin and nucleolin-overexpressing cells, as well as to the original target, TNF-α. These nanobodies presented cytotoxic effects in the micromolar range against these nucleolin-overexpressing cells. Grafting of the F3 peptide-derived sequence onto CDR3 enabled improved binding and cytotoxicity relative to grafting of the same sequence onto CDR1. However, the presence of flanking linkers in the grafted sequence did not alter the binding and cytotoxicity patterns. These results led to the selection of the nanobody presenting the F3 peptidederived sequence (without linkers) in CDR3 to generate a nanobody-Fc, upon fusion to the Fc region of a human IgG1. This anti-nucleolin nanobody-Fc antibody presented increased cytotoxic effects (in the nanomolar range) and also capacity of triggering a nucleolin-mediated ADCC effect against a cancer cell line. In conclusion, in this work, new nucleolin-targeting entities with cytotoxic activity against nucleolin-overexpressing cells were developed. In addition, the nanobodies presented bispecific properties, as evidenced by their binding to two different antigens. Notably, the nanobody-Fc antibody presented nucleolin-mediated ADCC capacity, which had not been described for this target yet. Therefore, the antibodies here described might contribute for the development of novel therapies targeting nucleolin.O cancro é atualmente a segunda principal causa de morte e as abordagens terapêuticas atuais ainda se revelam ineficazes em muitos casos. Assim, há necessidade de desenvolver agentes terapêuticos mais eficazes, principalmente para subtipos de cancro para os quais não existem terapias direcionadas e para os quais são evidentes as necessidades médicas não satisfeitas. A limitada penetração de fármacos nos tumores compromete a eficácia das terapias direcionadas para as células cancerígenas. Uma das estratégias para ultrapassar este problema é o direcionamento da terapia para a vasculatura tumoral, que se encontra mais acessível. Neste contexto, a nucleolina surge como um alvo de extrema relevância, uma vez que é sobre-expressa à superfície de células cancerígenas e células endoteliais angiogénicas, permitindo uma estratégia de direcionamento multicelular. Os anticorpos têm sido extensivamente estudados e alguns foram aprovados para o tratamento de diferentes tipos de tumores. Os anticorpos atuam através de diversos mecanismos, desde morte celular direta a mecanismos imunitários (através da região Fc do anticorpo). Nestes últimos, inclui-se a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), que desempenha um papel central na eficácia clínica de alguns destes agentes terapêuticos. No entanto, o elevado peso molecular destas proteínas (≈150 kDa) limita a penetração eficaz em tumores sólidos. Consequentemente, foram desenvolvidas unidades mais pequenas de reconhecimento de antigénio. Os nanobodies ou VHH são os domínios variáveis das cadeias pesadas dos anticorpos de camelídeos sem cadeias leves, apresentando tamanho reduzido (≈15 kDa), elevada afinidade para os seus antigénios e imunogenicidade reduzida em humanos. Além iv disso, os nanobodies são também plataformas versáteis para o desenvolvimento de diferentes formatos de anticorpos. O principal objetivo deste projeto foi o desenvolvimento e caracterização de novos formatos de anticorpos baseados em nanobodies contra a nucleolina. Estes formatos consistiram em (i) nanobodies obtidos por uma estratégia de inserção de um peptídeo de 10 de aminoácidos, derivado de um outro (designado por F3) com demonstrada ligação à nucleolina sobre-expressa à superfície de células cancerígenas e (ii) um anticorpo nanobody-Fc anti-nucleolina, com o objetivo de explorar mecanismos imunitários, nomeadamente ADCC. Além disso, este trabalho teve também o objetivo de explorar o uso de nanobodies como proteínas bi-específicas, tendo a nucleolina e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) sido selecionados como modelos de proteínas alvo. Um nanobody anti-TNF-α foi usado como base para inserção de sequências derivadas do péptido F3 na região determinante de complementaridade 1 (CDR1) ou 3 (CDR3), as duas regiões mais importantes na ligação ao antigénio. As sequências inseridas consistiram na referida sequência de 10 aminoácidos, com ou sem linkers em cada extremidade, os quais visavam aumentar a flexibilidade da CDR. Os nanobodies gerados apresentaram ligação a nucleolina purificada e a células que sobre-expressam nucleolina, assim como ao alvo original, TNF-α. Estes nanobodies apresentaram efeitos citotóxicos na ordem dos micromolar contra células que sobre-expressam nucleolina. A inserção da sequência derivada do péptido F3 em CDR3, resultou em ligação e citotoxicidade superiores às observadas com a inserção da mesma sequência em CDR1. Contudo, a presença de linkers nas extremidades da sequência inserida não alterou os padrões de ligação e citotoxicidade. Estes resultados levaram à seleção do nanobody com a sequência derivada do péptido F3 no CDR3 (sem linkers) para gerar um nanobody-Fc, após fusão a uma região Fc de uma IgG1 humana. Este anticorpo nanobody-Fc anti-nucleolina apresentou efeitos citótoxicos mais pronunciados (na ordem dos nanomolar) e também a v capacidade de promover um efeito de ADCC mediado por nucleolina, contra uma linha celular de cancro. Em conclusão, neste trabalho foram desenvolvidas entidades direcionadas para a nucleolina com atividade citotóxica contra células que sobre-expressam nucleolina. Além disso, os nanobodies apresentaram propriedades bi-específicas, como evidenciado pela sua ligação a dois antigénios diferentes. De notar que o anticorpo nanobody-Fc apresentou capacidade de ADCC mediada por nucleolina, um efeito que ainda não tinha sido descrito para este alvo. Desta forma, os anticorpos apresentados neste trabalho poderão contribuir para o desenvolvimento de novas terapias direcionadas para a nucleolina sobre-expressa em tumores