Efeito Protetor de Antocianinas na Inflamação Intestinal em Comparação com o Ácido 5-Aminosalicílico: Abordagens In Vitro e In Vivo

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, no ramo de Bioquímica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraInflammatory bowel disease (IBD) encompasses a set of chronic and relapsing inflammatory conditions of the gastrointestinal tract, whose incidence has markedly increased worldwide. Unfortunately, the etiology of this disease has not yet been fully elucidated and, as such, has yet no cure. In this sense, there has been an increasing interest in pharmacological alternatives, especially of natural origin. Anthocyanins, one of the subclasses of polyphenols abundant in the Mediterranean diet, are promising molecules in the context of IBD, considering their acknowledged anti-inflammatory and antioxidant properties. Thus, the work presented in this thesis explores the possibility of using dietary anthocyanins in the treatment of IBD, either per se or in combination with conventional drugs. For this, the activity of a typical anthocyanin, the cyanidin-3-glucoside (Cy3glc), was evaluated in comparison and in association with 5-aminosalicylic acid (5-ASA), in cellular pathways of relevance in the context of IBD, by using an in vitro model of macrophages. In addition, the anti-inflammatory and antioxidant activity of a fraction of anthocyanins prepared from blueberries (Vaccinium corymbosum L.) from the center region of Portugal was evaluated in comparison with 5-ASA, in an in vivo model of colitis induced by TNBS in rats. To better explore the mechanisms of action of the prepared fraction, and the interaction between macrophage and intestinal cells, it was also used an in vitro model of intestinal inflammation, consisting of a co-culture of macrophages (RAW 264.7) and intestinal epithelial cells (Caco-2). The results show that the isolated Cy3glc can inhibit the secretion of various pro-inflammatory mediators (•NO, PGE2 and TNF-alpha) and reactive oxygen species (ROS) production to a much greater extent than 5-ASA in macrophages. The decreased secretion of •NO and PGE2 is related to the inhibition of iNOS and COX-2 expression, but without interfering with NF-kB activation. Instead, this anthocyanin interferes with AP-1 signalling pathway, by reducing the phosphorylated of c-Jun in the nucleus, and inhibiting the activation of p38 and JNK MAPKs. Moreover, the combined use of Cy3glc with 5-ASA even suggests a synergistic effect. Concerning the blueberry fraction, it showed a high content and variety of anthocyanins, and it was in fact capable of reversing several parameters of intestinal inflammation in vivo. Its administration improved the body weight gain of treated rats and reduced colon lesions, its shortening, and wall thickening caused by local instillation of TNBS. This was accompanied by a marked reduction of active MPO and ALP in the colon tissue, a leukocyte infiltration indicator and an active inflammation biomarker respectively. The fraction also decreased relevant inflammatory mediators, such as iNOS and COX-2, while improving endogenous antioxidant defenses, namely the ratio of reduced versus oxidized glutathione (GSH/GSSG) and gluthatione peroxidade (GPX) activity. In general, the beneficial effects observed were much higher than those of 5-ASA, despite the much lower molar dose of anthocyanins. In vitro reults from intestinal epithelial cells and activated macrophages in a co-cultured system allowed to confirm the higher efficiency of this fraction in relation to 5-ASA. Incubation of the epithelial cells (apical compartment) with the fraction reduced the production of proinflammatory mediators by both cell types (apical and basolateral compartment), decreasing IL-6 secretion by apical epithelial cells, and •NO and IL-1β by basolateral macrophages. Intracellular ROS formation was also reduced in both cell types. These results also suggest the ability of anthocyanins to cross the intestinal barrier. In conclusion, the results presented highlight the potential of using anthocyanins, as isolated or in combination, for the control of intestinal inflammation. The activity of these molecules is complex, interfering with several mechanisms and signalling pathways closely related to the pathogenesis of IBD. Thus, the hypothesis of using dietary anthocyanins as a natural therapeutic approach in IBD is reinforced.A doença inflamatória intestinal (DII) abrange um conjunto de doenças inflamatórias crónicas recidivantes do trato gastrointestinal, cuja incidência tem aumentado visivelmente a nível mundial. Infelizmente, a etiologia desta doença ainda não está completamente esclarecida e, como tal, ainda não tem cura. Neste sentido, tem havido um interesse crescente em alternativas farmacológicas, especialmente de origem natural. As antocianinas, uma das subclasses de polifenóis abundantes na dieta Mediterrânica, são moléculas promissoras no contexto da DII, tendo em consideração as suas conhecidas propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes. Assim, o trabalho apresentado nesta tese explora a possibilidade de utilizar antocianinas da dieta no tratamento da DII, quer per si ou em combinação com fármacos convencionais. Para tal, avaliou-se a atividade de uma antocianina típica, a cianidina-3-glucósido (Cy3glc), em comparação e em associação com o ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), em vias de sinalização celular relevantes no contexto da DII, utilizando um modelo in vitro de macrófagos. Adicionalmente, foi explorada a atividade anti-inflamatória e antioxidante de um extrato enriquecido em antocianinas preparado a partir de mirtilos (Vaccinium corymbosum L.) da região centro de Portugal, em comparação com o 5-ASA, num modelo in vivo de colite induzida por TNBS em rato. De forma a melhor explorar os mecanismos de ação do extrato e a interação entre macrófagos e células intestinais, foi ainda utilizado um modelo in vitro de inflamação intestinal constituído por uma co-coltura de macrófagos (RAW 264.7) e de células epiteliais intestinais (Caco-2). Os resultados obtidos demonstram que a Cy3glc isolada tem capacidade para inibir a secreção de vários mediadores pró-inflamatórios (•NO, PGE2 e TNF-alpha) e a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) numa extensão muito superior ao 5-ASA em macrófagos. A diminuição da secreção de •NO e PGE2 está relacionada com a inibição da expressão, respectivamente, de iNOS e COX-2 mas sem interferir com a ativação do NF-kB. Alternativamente, esta antocianina interfere na via de sinalização da AP-1, reduzindo a fosforilação de c-Jun no núcleo e inibindo a ativação das MAPKs p38 e JNK. Além disso, a utilização combinada de Cy3glc e 5-ASA chega a sugerir um efeito sinérgico. Quanto ao extrato obtido a partir de mirtilos demonstrou conter um elevado teor e variedade de antocianinas, e ser de facto capaz de reverter vários parâmetros de inflamação intestinal in vivo. A sua administração melhorou o aumento de peso corporal dos ratos tratados e reduziu as lesões no colon, o seu encurtamento e o espessamento da parede causados pela instilação local de TNBS. Tal foi acompanhado por uma marcada redução da MPO ativa e da ALP no tecido do colon, biomarcadores de infiltração leucocitária e de inflamação ativa. Diminuiu igualmente mediadores inflamatórios relevantes, como a iNOS e a COX-2, melhorando simultaneamente as defesas antioxidantes endógenas, nomeadamente a proporção de glutatião reduzido versus oxidado (GSH/GSSG) e a atividade da glutatião peroxidase (GPX). No geral, os efeitos benéficos observados foram muito superiores aos do 5-ASA, apesar da dose molar de antocianinas ser muito inferior. Resultados in vitro em células epiteliais intestinais e macrófagos ativados, num sistema de co-cultura, permitiu confirmar a maior eficácia do extrato relativamente ao 5-ASA. A incubação das células epiteliais com o extrato (compartimento apical) reduziu a produção de mediadores pró-inflamatórios por ambos os tipos celulares (compartimento apical e basolateral), diminuindo a secreção de IL-6 pelas células epiteliais apicais, e de •NO e IL-1β pelos macrófagos basolaterais. A formação de ROS intracelulares foi igualmente reduzida em ambos os tipos celulares. Estes resultados sugerem ainda a capacidade das antocianinas atravessarem a barreira intestinal. Em conclusão, os resultados apresentados destacam o potencial da utilização de antocianinas, quer isoladas ou em combinação, no controlo da inflamação intestinal. A atividade destas moléculas é complexa, interferindo em vários mecanismos e vias de sinalização celulares estreitamente relacionadas com a patogénese da DII. Desta forma, fica reforçada a hipótese de utilização de antocianinas alimentares como uma abordagem terapêutica natural na DII