Head and Neck Squamous Cell Carcinoma: integrating genomic, epigenetic and transcriptomic data - from bench to clinical applications

Tese de doutoramento do Programa Interuniversitário de Doutoramento em Envelhecimento e Doenças Crónicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraHead and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is an emergent health problem worldwide. These tumors present heterogeneity at phenotypic, aetiological, biological and clinical level. In developed countries, smoking and alcohol are implicated in the increase of HNSCC cases, and human papillomavirus is an important risk factor, especially in the rise of oropharyngeal tumors without smoke and alcohol habits. A significant percentage of HNSCC patients develop loco-regional and distant recurrences. Even with progresses in surgery, radiation and chemotherapy, approximately half of all patients die of the disease. Risk stratification for HNSCC is essencial in order to decrease mortality and improve quality of life of the patients. The great HNSCC heterogeneity makes difficult to understand the molecular carcinogenesis process as well as to develop early detection and therapeutic strategies for these tumors. Nowadays, the majority of genome-wide molecular profiling studies of HNSCC are limited to single approaches, which hampers the identification of accurate and robust biomarkers of early diagnosis and prognosis. Indeed, there is a lack of proven biomarkers for predicting clinical outcomes and response to treatment. The present work aimed to perform a molecular characterization of HNSCC in order to predict recurrence/metastasis development and signaling pathways associated to targeted therapy and resistance to conventional drugs through the identification of different molecular groups with apparently different survival profiles using genomic, epigenetic and transcriptomic approaches. We analyzed the same HNSCC patients through different molecular technologies, being the identified biomarkers and molecular signatures validated with TCGA (The Cancer Genome Atlas) data. First, we performed a direct genetic and epigenetic characterization of HNSCC patients, using specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) and Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA) probe panels. We reported different genetic signatures related to tumor stage and anatomic site as well as tobacco use. Additionally, specific genomic and epigenetic signatures associated to patients' risk of recurrence/metastasis development after treatment of primary tumor and also to survival were identified. The genetic analysis of non-tumor samples (from surgical margins) revealed some imbalances similar to those identified in the tumor samples, which reinforce the importance of molecularly analyze the high-risk patients even before the visible morphological changes and also the suspicious lesions in order to early diagnose these tumors and their recurrences. Secondly, we moved forward to a high-throughput genomic and transcriptomic approaches and we identified molecular signatures with capability to predict the recurrent/metastatic disease development and clinical outcome. In these studies using either direct probe panels or genome-wide approaches we identified the most common chromosomal regions with imbalances and altered genes. As expected, whole-genome techniques revealed new chromosomal regions and genes that seem to have a role in HNSCC development and behavior. Overall, through these comprehensive genomic, epigenetic and transcriptomic characterization we identified biomarkers and molecular signatures of prognosis and survival, which open the door for personalized medicine in HNSCC patients. Finally, we applied these genomic and epigenetic technologies to perform a molecular characterization of four paradigmatic HNSCC patients in order to prove the benefit of these molecular knowledgement to the clinical management of the HNSCC patients. Several chromosomal regions and genes related to radiation and/or chemotherapy resistance and to patients' prognosis and survival were identified, which could help and guide the type or intensify of treatment modalities. Moreover, molecular characterization of commercial HNSCC cell lines and primary cell cultures established from these patients was conducted, which revealed the ploidy and the complex structural chromosomal rearrangements of HNSCC tumors. This comprehensive characterization enables cell models for further studies both in radiation and pharmacogenomics fields, as well as to understand the molecular mechanisms of HNSCC development and progression. With this work we performed a robust molecular characterization of HNSCC, using different omic approaches in the same tumor samples, which allowed the identification of new prognostic biomarkers and molecular signatures with potential to be translated to clinical practice.O carcinoma epidermóide da cabeça e pescoço (CECP) é um problema emergente de saúde em todo o mundo. Estes tumores são heterogéneos a nível fenótipico, etiológico, biológico e clínico. Nos países desenvolvidos, o tabaco e o álcool estão implicados no aumento do número de casos de CECP e o papiloma vírus humano é um fator de risco importante para o aumento dos tumores da orofaringe não relacionados com hábitos tabágicos e de álcool. Uma percentagem significativa de doentes com CECP desenvolve recidivas loco-regionais e à distância. Mesmo com os progressos na cirurgia, radioterapia e quimioterapia, cerca de metade de todos os doentes morre devido ao CECP. A estratificação do risco de CECP é essencial de forma a contribuir para a diminuição da mortalidade e melhoria da qualidade de vida destes doentes. A heterogeneidade do CECP dificulta por um lado a compreensão dos processos moleculares da carcinogénese e por outro lado o desenvolvimento de estratégias de deteção precoce e de terapêutica. Atualmente, a maioria dos estudos moleculares de grande escala são restritos, o que dificulta a identificação robusta e precisa de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico. De facto, há falta de biomarcadores para predizer o desenlace clínico e resposta ao tratamento. O presente trabalho teve como objetivo caraterizar molecularmente o CECP de forma a prever o desenvolvimento de recidivas/metástases e a identificação de vias de sinalização associadas a terapias alvo e resistência às terapias convencionais, através da identificação de diferentes grupos moleculares com diferentes sobrevivências, usando abordagens de genómica, epigenética e transcriptómica. Neste estudo, analisámos os mesmos doentes com CECP usando diferentes tecnologias moleculares, tendo validado os biomarcadores e assinaturas moleculares identificados usando dados do portal TCGA (The Cancer Genome Atlas). Em primeiro lugar, realizámos uma caraterização genética e epigenética do CECP direcionada, utilizando painéis de sondas específicos de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) e Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA). Identificaram-se diferentes assinaturas genéticas relacionadas com o estadio do tumor e as localizações anatómicas, bem como com o consumo de tabaco. Adicionalmente, uma assinatura genética e epigenética associada ao risco dos doentes desenvolverem recidivas/metástases após o tratamento do tumor primário e também associada à sobrevivência, foi identificada. A análise genética das amostras não tumorais (provenientes das margens cirúrgicas) revelou alguns desequilíbrios similares aos identificados nas amostras tumorais, o que reforça a importância de analisar molecularmente os doentes de elevado risco mesmo antes de qualquer alteração morfológica visível e também das lesões suspeitas, de forma a diagnosticar precocemente estes tumores e as suas recidivas. Na segunda parte do estudo utilizámos abordagens genómicas e transcriptómicas de larga escala e, identificámos assinaturas moleculares capazes de prever o desenvolvimento de recidivas/metástases e evolução clínica dos doentes. Estes estudos, usando quer painéis de sondas direcionados quer abordagens de todo o genoma, permitiram identificar as regiões cromossómicas e genes mais comummente alterados. As técnicas de análise de todo o genoma revelaram novas regiões cromossómicas e genes que parecem desempenhar um papel no desenvolvimento e evolução clínica do CECP. No geral, através desta caraterização genómica, epigenética e trasncriptómica, identificámos biomarcadores e assinaturas moleculares de prognóstico e sobrevivência, o que abre novas portas para a medicina personalizada no CECP. Finalmente, utilizámos estas tecnologias de genómica e epigenética para caraterizar quatro doentes paradigmáticos com CECP de forma a provar o benefício deste conhecimento molecular na conduta clínica. Várias regiões cromossómicas e genes relacionados com a resistência à radiação, quimioterapia, prognóstico e sobrevivência foram identificados, o que poderia ajudar na escolha do tipo e intensidade das modalidades de tratamento. Adicionalmente, foi realizada a caraterização molecular de linhas comerciais de CECP e de culturas primárias estabelecidas a partir destes doentes de CECP, o que revelou a ploidia e rearranjos estruturais complexos destes tumores, garantindo modelos celulares para futuros estudos no campo da radiação e farmacogenómica e ainda para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares de desenvolvimento e progressão do CECP. Este trabalho permitiu, de uma forma robusta, caracterizar molecularmente o CECP, usando diferentes abordagens ómicas nas mesmas amostras tumorais, ajudando assim a identificar novos biomarcadores de prognóstico e assinaturas moleculares com potencial translação à clínica