Aspects of molecular ecology of carnivore viruses : sapovirus and coronavirus

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaCurrent knowledge on the epidemiology of many pathogens of wild animals is limited and little is known about their genetic diversity, geographic and host species range, and their potential to spread between wild, domestic and human species. This thesis, developed at the Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research, includes two studies that seek to contribute to increase the knowledge in this field. The first study aimed to test the hypothesis that consecutive outbreaks of Sapovirus (SaV) infection in spotted hyenas (Crocuta crocuta), detected by a previous study on this species in the Serengeti National Park, resulted from the emergence of antigenically different strains of the virus. Virus RNA was extracted from faecal samples obtained from three infected hyenas and amplified using conventional RT-PCR methods, with the aim of sequencing a fragment of the virus genome known to be important in determining the antigenic type of SaV strains. Although a diverse set of primer pairs were tried, only a partial sequence of the targeted gene was obtained from one sample, thus it was not possible to determine if the outbreaks of SaV infection among spotted hyenas in the Serengeti were caused by distinct antigenic strains. The second study targeted aminopeptidase N (APN), a protein known to work as the host cell receptor for a great number of alphacoronaviruses (α-CoVs). In vitro studies have demonstrated that canine and feline APNs can facilitate the entry of α-CoVs from different species into these carnivore’s cells. This work aimed to investigate the phylogenetic relation between APN from different carnivore species. A particular focus was given to the region known to interact with α-CoVs during cell entry, with the purpose to better understand the possibility of α-CoVs from particular host species successful extending their range of hosts. The detection of isoforms of APN was also sought. The amplification and sequencing of nine tissue samples of wild carnivores was performed using conventional RT-PCR and molecular cloning methods, followed by the phylogenetic analysis of the results. Seven partial sequences of APN were obtained and their phylogenetic relation corresponded to that of their animals of origin. However, the analysis of the specific region where the virus attaches revealed that the species from the families Hyaenidae and Herpestidae (suborder Feliformia) were phylogenetically more similar to the species from Caniformia suborder rather than those from Feliformia suborder. This suggests that α-CoVs that infect the species in these two families might extend their host range to species in Caniformia rather than Feliformia suborder. The results obtained complement the already existing information on both Sapovirus and APN.RESUMO - Aspetos da ecologia molecular de vírus de carnívoros: Sapovirus e Coronavirus - O conhecimento atual sobre a epidemiologia de muitos agentes patogénicos em animais selvagens é limitado e pouco se sabe sobre a sua diversidade genética, a sua extensão geográfica e de espécies hospedeiras, e o seu potencial de propagação entre espécies selvagens, domésticas e humana. Esta tese, desenvolvida no Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research, inclui dois estudos que procuram contribuir para o aumento do conhecimento nesta área. O primeiro estudo procurou testar a hipótese de que surtos consecutivos de infeção por Sapovirus (SaV) em hienas-malhadas (Crocuta crocuta), detetados por um estudo prévio nesta espécie no Parque Nacional do Serengeti, resultaram da emergência de estirpes antigenicamente diferentes do vírus. O RNA do vírus foi extraído de amostras fecais obtidas de três hienas infetadas e amplificado usando métodos convencionais de RT-PCR, com o objetivo de sequenciar um fragmento do genoma viral que se sabe ser importante para a determinação do tipo antigénico das estirpes de SaV. Apesar de terem sido experimentados vários conjuntos de primers, apenas foi obtida uma sequência parcial do gene-alvo de uma amostra, pelo que não foi possível determinar se os surtos de infeção por SaV entre as hienas-malhadas no Serengeti foram causados por estirpes antigenicamente distintas. O segundo estudo visou a aminopeptidase N (APN), uma proteína conhecida como recetor celular para um grande número de alfa-coronavirus (α-CoVs). Estudos in vitro demonstraram que as APNs canina e felina conseguem facilitar a entrada de α-CoVs de diferentes espécies nas células destes carnívoros. Este trabalho teve por objetivo investigar a relação filogenética entre a APN de diferentes espécies de carnívoros. Uma atenção particular foi dada à região que se sabe interagir com os α-CoVs durante a sua entrada na célula, com o propósito de melhor compreender a possibilidade de α-CoVs de uma espécie hospedeira particular alargarem com sucesso o seu leque de hospedeiros. Procurou-se também a presença de isoformas da APN. A amplificação e sequenciação de nove amostras de tecidos de carnívoros selvagens foram realizadas usando métodos convencionais de RT-PCR e métodos de clonagem molecular, seguidos da análise filogenética dos resultados. Sete sequências parciais da APN foram obtidas e a sua relação filogenética correspondeu à dos seus animais de origem. No entanto, a análise da região específica onde o vírus adere revelou que as espécies das famílias Hyaenidae e Herpestidae (subordem Feliformia) eram filogeneticamente mais semelhantes a espécies da subordem Caniformia do que da subordem Feliformia. Isto sugere que α-CoVs que infetem espécies desta duas famílias possam estender a sua variedade de hospedeiros a espécies da subordem Caniformia em vez da subordem Feliformia. Os resultados obtidos complementam a informação já existente acerca do SaV e do APN.N/