Regulação do transportador KtrAB por c-di-AMP em Bacillus subtilis

Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada (área de especialização em Biomedicina)Potassium is the major cation present in all living cells and has a crucial role in bacteria where it is involved in several processes such as osmoregulation, pH homeostasis and membrane potential adjustment. The KtrAB protein complex is the principal potassium transporter present in Bacillus subtilis and is composed by a regulatory subunit, KtrA, and a membrane protein, KtrB. This transporter can be regulated by an exchange of ATP/ADP and by c-di-AMP, a secondary messenger recently discovered. It has been postulated that the regulation of KtrAB by c-di-AMP occurs at two levels, by direct interaction with the regulatory subunit, KtrA, leading to an inhibition of potassium transport, and by interaction with the ydaO riboswitch, leading to an inhibition of KtrAB expression. However, studies performed until now are very preliminary and an extensive study is necessary. In this project the regulation of KtrAB transporter by c-di-AMP was characterized in the context of Bacillus subtilis. Using genetic techniques, single point mutations were inserted in the binding sites for c-di-AMP in KtrA and in ydaO riboswitch and multiple bacterial strains were constructed. The phenotype of these strains was evaluated using several functional tests to assess the impact of c-di-AMP in KtrAB regulation. Strikingly, none of the mutations inserted had an impact at a phenotypical level. However, biochemical tests demonstrate that these mutations alter c-di- AMP binding, particularly in KtrA. In agreement with the results obtained it is possible to conclude that c-di-AMP does not have an important effect in KtrAB regulation, contrary to what has been reported. In fact, it seems that Bacillus subtilis have other compensatory mechanisms that allow it to overcome the effects of mutations inserted.Potássio é o catião presente em maior concentração em todos os sistemas vivos. Este ião possui um papel crucial em bactérias onde está envolvido em vários processos celulares, por entre os quais osmorregulação, homeostasia de pH e ajuste de potencial de membrana. O complexo KtrAB é o principal transportador de potássio presente em Bacillus subtilis e é composto por uma subunidade reguladora, KtrA, e por uma proteína de membrana, KtrB. Este transportador é regulado por uma troca constante entre ATP/ADP e por c-di-AMP, um mensageiro secundário recentemente descoberto. Tem sido postulado que a regulação de KtrAB por c-di-AMP ocorre a dois níveis distintos, por interação direta com a subunidade reguladora KtrA, levando a uma inibição do transporte de potássio, e por interação com o riboswitch ydaO, levando a uma inibição da expressão de KtrAB. Porém, os estudos realizados até então são bastante preliminares e um estudo extensivo tornou-se necessário. Neste projeto, a regulação do transportador KtrAB por c-di- AMP foi caracterizada no contexto celular de Bacillus subtilis. Usando técnicas de engenharia genética foram inseridas mutações pontuais nos locais de ligação do c-di-AMP em KtrA e no riboswitch ydaO, levando à criação de várias estirpes de Bacillus subtilis. O fenótipo destas estirpes foi avaliado usando ensaios funcionais de forma a entender o papel de c-di-AMP na regulação de KtrAB. Contudo, nenhuma das mutações inseridas demonstrou qualquer impacto a nível fenotípico. Por outro lado, testes bioquímicos demonstraram que estas mutações alteram a ligação de c-di-AMP, particularmente em KtrA. De acordo com os resultados obtidos é possível concluir que o c-di-AMP não tem um efeito importante na regulação de KtrAB, contrariamente aquilo que tem sido reportado. De facto, parece que Bacillus subtilis possui outros mecanismos de compensação que lhe permitem ultrapassar os efeitos das mutações inseridas