Therapeutic and Diagnostic Approaches Using Recombinant Protein and Aptamers

Doctor최근 항체와 케모카인 같은 단백질들을 이용한 단백질 치료제를 개발하는 연구들이 많이 진행 중이다. 단백질 치료제는 단백질을 변형시키거나 추가적인 물질을 결합시킴으로서, 그 효과를 증대시키기 거나 안정성을 높일 수 있다. 이러한 연구들은 보다 효과적인 단백질 치료제로서 활용이 가능하다. 또한 압타머는 항체의 단점을 보완 할 수 있는 대체 물질로서 최근 각광받고 있다. 이러한 압타머를 이용하여 질병의 진단을 가능케 하기 위한 연구들이 많이 진행중이다. 본 연구에서는 SDF-1 단백질을 변형시켜 보다 효과적인 치료제로서의 가능성을 보였고, 또한 바이오마커에 대한 압타머를 개발하여 이를 이용한 질병진단의 센서를 개발하였다. SDF-1은 항상성 유지를 위한 chemokine으로서 심근손상 이후에 cell homing, tumor metastasis, angiogenesis 및 tissue regeneration 등 매우 많은 역할을 담당하고 있는 단백질이다. SDF-1은 N-말단의 Lys1과 Pro2 잔기가 그 수용체인 CXCR4 단백질과 특이적으로 결합함으로서 그 기능을 수행하기 때문에 매우 중요하다. 하지만 생체 내에서 SDF-1 단백질은 N-말단을 선택적으로 잘라내는 DPPIV/CD26 과 같은 dipeptidyl peptidase에 의해 그 활성이 조절 되는 것으로 알려져 있기 때문에 SDF-1의 활성을 높이기 위해서는 N-말단의 잔기를 보호하는 것이 매우 중요하다. 그러므로 본 연구에서는 N-말단에 여분의 아미노산(Ser-Gly-Ser)을 포함하는 recombinant SDF-1을 E.coli에서 발현을 유도하였으며, 정확한 타켓팅을 위해 MRI 조영제인 Gd-DOTA를 결합시킨 단백질을 만들었다. 이를 chemotaxis cell migration assay을 이용해 활성도를 측정 한 결과 recombinant SDF-1와 Gd-SDF-1 모두 DPPIV/CD26에 대한 저항성을 가짐을 확인 할 수 있었다. 이러한 SDF-1은 치료용 단백질로서의 가능성을 보다 높인 결과라 할 수 있다.심장세포에서 Troponin I(cTnI)는 심근경색의 초기에 매우 많은 양이 발현 되는 것으로 알려져 있어, 질병의 조기 진단에 매우 중요한 biomarker로 알려져 있다. 그러므로 본 연구에서는 cTnI를 조기 검출하기 위해, 항체와 더불어 단백질과 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 aptamer의 개발 및 이를 이용한 biosensor를 개발하였다. cTnI는 E.coli 시스템에서 발현되었고 FPLC를 이용하여 매우 고순도의 단백질을 정제하였다. 이를 이용하여 magnetic bead를 이용한 Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (SELEX)기법 을 통해 cTnI와 특이적으로 결합하는 ssDNA를 개발하였다. Aptamer를 이용한 biosensor를 개발하기 위해 electrochemical impedance spectroscopy (EIS) 시스템을 도입하여 측정한 결과, buffer 조건에서는 1.08 nM, FBS solution 조건에서는 2.45 nM의 검출 한계를 갖는 biosensor를 성공적으로 개발했다. 개발된 biosensor는 BSA와 Lysozyme과의 경우는 signal 변화가 없는 것을 확인함으로서 cTnI에만 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 실제 환자의 serum 샘플에 적용하였을 때 1.5 nM cTnI의 검출이 가능함을 보였다. 이렇게 개발된 aptamer 및 biosensor는 의학적으로 응용하였을 때, 심근경색의 진단에 사용이 가능 할 것으로 보인다. 말라리아 질병을 보다 간단하고 빠르게 진단하기 위해 많은 연구가 진행 중이다. 본 연구에서는 말라리아 기생충에서 발현하는 biomarker인 plasmodium lactate dehydrogenase (pLDH)에 대한 aptamer를 SELEX기법을 이용하여 개발 하였고, 표적단백질에 매우 효과적으로 결합함을 확인하였다. (Kd = 16.8 ~ 49.6 nM). 또한 이를 이용한 검출 시스템을 개발 하기 위해, cationic polymer와 gold nanoparticle을 도입하였다. Gold nanoparticle은 cationic polymer와 결합함으로서 침전이 일어나며, 붉은 색에서 보라색으로 색깔이 변하는 특성을 가지고 있다. 또한 DNA는 음전하를 띄기 때문에 cationic polymer와 매우 잘 결합하는 특성을 가지고 있다. 이러한 화학적 특성을 이용해 말라리아의 biomarker인 pLDH를 1 nM까지 눈으로 보았을 때 바로 확인이 가능한 검출 방법을 고안하였다. 또한 실제 말라리아 기생충에 감염된 환자 혈액을 이용한 경우에서도 UV spectrum을 이용한 gold nanoparticle의 침전 정도를 분석한 결과, 80 parasites까지 검출이 가능함을 보였다.Therapeutic recombinant proteins, such as antibodies and chemokines, are increasingly being used in the treatment of disease. Therapeutic proteins have been modified to enhance the bioavailability and stability of conventional proteins to provide more efficient biopharmaceutical treatment. Moreover, aptamers are considered alternatives to antibodies in both therapeutic and diagnostic applications, because they have many advantages in overcoming the limitations of antibodies. This study produced a more efficient therapeutic protein, SDF-1 chemokine protein to provide the possibility of a biopharmaceutical treatment for acute myocardial infarction. In addition, atpamers against the biomarkers for myocardial infarction and malaria were identified and then used to develop a more accurate sensing system for the diagnosis of disease.The SDF-1 protein is a homeostatic chemokine with multiple roles in cell homing, tumor metastasis, angiogenesis, and tissue regeneration after acute injuries. The N-terminal residues of SDF-1 participate in the binding and activation of the target receptor. In particular, Lys1 and Pro2 directly interact with the CXCR4 receptor. DPPIV/CD26 selectively cleaves dipeptide from the N-terminus of substrates containing proline or alanine in the second position. In addition, a slow remove has been reported for dipeptides composed of X-Ser or X-Gly. It is known that SDF-1 is digested by DPPIV/CD26 and loses binding activity to the CXCR4 receptor. MRI with contrast agents have been used to localize and quantify the extent of myocardial infarction following reperfusion. Specially, intravenous contrast agents based on chelates of gadolinium are the most commonly used.In this study, we made a recombinant SDF-1 with three additional N-terminal amino acids (Ser-Gly-Ser). Moreover, the Gd-DOTA complex was synthesized, and then the Gd complex was conjugated with SDF-1 through non-specific coupling to target the myocardial infarction area. After the recombinant SDF-1 and Gd-SDF-1 were incubated with DPPIV/CD26, digested protein activities were measured by a chemotaxis cell migration assay. The chemotatic activities of the cleaved SDF-1 and Gd-SDF-1 were similar to those of the recombinant SDF-1. Thus, DPPIV/CD26-resistant Gd-SDF-1 could provide an efficient treatment for AMI when SDF-1 is directly injected into the heart after myocardial infarction.Cardiac troponin I (cTnI) is the reliable biomarkers for the early diagnosis of acute myocardial infarction (AMI). Herein, ssDNA aptamers against cTnI were discovered using Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (SELEX) method. The aptamers were selectively bound to both of cTnI and cardiac Troponin complex. The binding affinities of the cTnI aptamers were measured using surface plasma resonance (SPR)the cTnI aptamers showed lower Kd value compared to the cTnI antibody. Moreover, the cTnI aptamers were used to electrochemical impedance spectroscopy (EIS) for detection of cTnI. The recombinant cTnI was successfully detected to 2 nM, and the calculated detection limit was 1.08 nM in buffer condition. Also, it was detected to 20 nM, and calculated detection limit was 2.45 nM in FBS solution. Specificity test of cTnI aptamers clearly showed that the aptamers only bound to cTnI specifically, whereas it did not bind to Lysozyme or BSA at same conditions. Furthermore, when this cTnI aptasensor was applied to serum from patients, we could successfully detect cTnI. Thus, the cTnI aptamers and the aptasensor could be applied to detect cTnI, providing the possibility of diagnosing AMI.Malaria, a major burden of disease caused by parasites of the genus Plasmodium, is widely spread in tropical and subtropical regions. Thus, malaria diagnosis and treatment are very important to save human lives. Herein, we have successfully developed a diagnostic technique for malaria which is simple, rapid, and highly sensitive. The proposed method is based on the interaction among the Plasmodium lactate dehydrogenase (pLDH), which is a biomarker for malaria, and pL1 aptamer against P. vivax lactate dehydrogenase (PvLDH) and P. falciparum lactate dehydrogenase (PfLDH). In addition, the cationic polymers, PDDA and PAH, aggregate AuNPs that should be possible to observe the change in color from red to blue, which is depend on the concentration of pLDH. Using this aptasensor, pLDH proteins were successfully detected with low detection limits. The limits of detection for PvLDH were determined as 8.7 pM for PDDA and 8.3 pM for PAH. Moreover, the specificity test was proved that the aptasenor have very specific to target proteins over other interfering proteins. In addition, the pLDH from infected blood samples of the two main species of malaria were also detected. The limits of detection for P. vivax were determined as 80 parasites/µL for PDDA and 74 parasites/µL for PAH. The aptasenor has great advantages which can simply and rapidly diagnose the malaria. Thus, the developed aptasensor for detection of pLDH can offer an effective and sensitive diagnosis of malaria