Développement de marqueurs fluorogéniques bioorthogonaux pour l'imagerie biologique

Studying protein activities could help us to understand the complex mechanisms controlling cells and organisms. Our laboratory recently developed Fluorescence-Activating and absorption-Shifting Tag (FAST), a small fluorogen-based reporter enabling to fluorescently label fusion proteins in living cells. My PhD thesis presents the developments of new FAST systems with various properties for multiplexed imaging. We report a collection of fluorogens enabling to tune the fluorescence color of FAST from green-yellow to orange and red. Beyond allowing multicolor imaging of FAST-tagged proteins in live cells, these fluorogens enable dynamic color switching because of FAST’s reversible labeling, opening great prospects for the design of selective imaging methods relying on dynamic systems. In order to further expand the spectral properties of FAST to red, we also designed and developed a library of red fluorogenic dyes, for which we engineered specific protein binders by applying a directed evolution strategy based on the yeast display technology and high-throughput fluorescence activating cell sorting (FACS). We finally developed novel fluorogens able to form fluorescent complexes with FAST, but incapable of crossing the plasma membrane, which makes it possible to selectively detect FAST-tagged cell-surface proteins.L'étude de la dynamique des protéines est essentielle pour comprendre les processus biologiques. Notre laboratoire a développé une nouvelle classe de protéines fluorescentes semi-synthétiques, appelée Fluorescence-Activating and absorption-Shifting Tag (FAST). Cette thèse de doctorat présente le développement de nouveaux systèmes FAST avec diverses propriétés pour l'imagerie multiplexée. Nous avons développé une série de fluorogènes permettant de modifier la couleur de FAST de vert-jaune à orange et rouge. Au delà de l’application de l’imagerie multi-couleurs, ces fluorogènes permettant un échange dynamique des couleurs grâce à la liaison réversible de FAST, ouvrant de nouvelles perspectives pour le développement de méthodes d’imagerie sélective reposant sur la dynamique de systèmes réactifs. Pour étendre davantage les propriétés spectrales de FAST vers le rouge lointain, nous avons développé une nouvelle série de fluorogènes rouges, pour lesquels nous avons sélectionné par une stratégie d'évolution dirigée basée sur le yeast display et la cytométrie en flux de nouveaux tags protéiques capables d’interagir avec ces fluorogènes et d’activer leur fluorescence. Nous avons enfin développé de nouveaux fluorogènes capables de former des complexes fluorescents avec FAST, mais incapables de traverser la membrane plasmique, ce qui permet de détecter sélectivement les protéines membranaires