Ingénierie de génome de bactéries minimales par des outils CRISPR/Cas9

Mycoplasmas are small pathogenic bacteria that are characterized by reduced genomes of about 1 Mbp with a low G+C content. The interest of the scientific community towards these species has been recently renewed by successful synthesis of their genome and transplantation experiments. These new genetic tools opened the way to further applications and developments for large-scale genome engineering programmes. CRISPR/Cas systems are natural systems that provide bacteria and archaea with an adaptive defense mechanism against invading nucleic acids. The CRISPR system from Streptococcus pyogenes includes an endonuclease (SpCas9) and two CRISPR RNAs (crRNA et tracrRNA) which role are to drive Cas9 to a target sequence. Target recognition depends on a specific pairing of the crRNA and the presence of a motif named protospacer adjacent motif (PAM). After recognition, Cas9 cleaves the targeted DNA. From the natural S. pyogenes system, a simplified genetic tool including Cas9 and a guide RNA (gRNA) was developed for many organisms . The first goal of my thesis was to combine the synthetic biology methods of genome cloning in yeast and back transplantation into recipient cells with a CRISPR/Cas9 tool for efficient engineering of mycoplasma genomes cloned in yeast. We succeeded in removing genes and genomic regions in three different species, Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum and M. pneumoniae. Then, in order to develop a system optimized for mycoplasma genome editing, we characterized a natural CRISPR/Cas9 system derived from Mycoplasma gallisepticum (Mg). Using a combination of in silico and in vivo approaches, MgCas9 PAM sequence was characterized as NNNAAAA. We then started to develop a minimal CRISPR/Cas system from M. gallisepticum for direct genome editing in mollicutes. Thus we introduced MgCas9 encoding gene in Mmc and tried to activate it with a newly designed gRNA, a chimeric molecule between the crRNA and the tracrRNA of M. gallisepticum, without success yet.Les mycoplasmes sont des bactéries pathogènes, dotées de petits génomes d’environ 1Mbp, avec une faible teneur en G+C. L'intérêt de la communauté scientifique pour ces bactéries a été récemment renouvelé par des avancées dans les domaines de la synthèse et de la transplantation de génomes. Ces nouvelles approches ont ouvert la voie à l'ingénierie génomique à grande échelle des mycoplasmes. Les systèmes CRISPR/Cas sont des systèmes de défense adaptatifs procaryotes contre les acides nucléiques invasifs. Le système CRISPR de Streptococcus pyogenes est composé d’une endonucléase (SpCas9) et de deux CRISPR ARNs (crRNA et tracrRNA) qui dirigent Cas9 vers sa séquence d’ADN cible. La reconnaissance de l’ADN cible se fait par appariement du crRNA et de la présence en aval d’une séquence nommée protospacer adjacent motif (PAM). Apres cette reconnaissance, Cas9 coupe l’ADN cible. A partir de ce système, un outil génétique simplifié composé de Cas9 et d’un ARN guide (gRNA) a été développé pour de nombreux organismes. Le premier objectif de ma thèse était de combiner les méthodes de biologie synthétique de clonage et de la transplantation de génomes avec les outils CRISPR/Cas9 pour l’ingénierie des génomes de mycoplasmes clonés dans la levure. Nous avons réussi à utiliser cette approche pour enlever des gènes et des régions génomiques dans trois espèces: Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), M. capricolum subsp. capricolum et M. pneumoniae. Afin de développer un système plus adapté aux mycoplasmes, nous avons ensuite caractérisé le système CRISPR/Cas9 de Mycoplasma gallisepticum (Mg). En utilisant une combinaison d'approches in silico et in vivo, la séquence PAM de MgCas9 a été caractérisée comme NNNAAAA. Nous avons alors entrepris de développer un système CRISPR/Cas minimal de M. gallisepticum pour une utilisation directe dans les cellules de mollicutes: le gène codant MgCas9 a été introduit dans le génome de Mmc, mais son activation avec un gRNA chimère entre le crRNA et le tracrRNA de M. gallisepticum n’a pas été obtenue pour le moment