Role of Mi-2 in chromatin regulation to regulate neural stem cell fate and life-span in Drosophila melanogaster

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Drosophila central nervous system (CNS) is an ideal model to study development and cell diversity. Neuroblasts (NBs) are the neural precursor cells in the central brain of Drosophila and divide asymmetrically to self-renew and differentiate along diverse lineages. During this asymmetric division, they form a larger daughter cell, that retains NB features, and a smaller daughter cell, more committed and that will eventually form neurons or glial cells. NBs are generated in embryonic stages and start dividing, setting a first pool of neural differentiated cells. After a short quiescence period at the beginning of larval stage, they re-enter cell cycle and keep dividing, setting a second wave of neurogenesis. As animals transition to pupal stages, NBs suffer a gradual cell size reduction which sets the start for its proliferation termination that ultimately occurs at the end of metamorphosis. The time at which NBs leave cell cycle is highly regulated and important to both assure that the correct number of neuronal differentiated cells are formed and to prevent uncontrolled overgrowth of the brain. The mechanisms that regulate cell cycle exit in neuroblasts are, however, not-fully know. In stem cells, specific genes are gradually silenced as differentiation occurs, while lineage specific genes are turned on. This transcriptional transition is partly controlled by chromatin regulatory mechanisms, such as covalent histone modifications and ATP-dependent chromatin remodeling. The importance of such epigenetic regulation, led to believe that chromatin regulators would have a role in this process of NBs cell cycle exit and entry in a more committed fate. To test this hypothesis, I tested if chromatin regulators regulate NBs fate and lineage differentiation during development. This study is a contribution to the understanding of how epigenetic regulators act in a complex manner to modulate transcription of key genes involved in stem cell differentiation.Para o correto desenvolvimento do cérebro, as células estaminais que darão origem a todas as células diferenciada nele presentes têm que proceder à sua diferenciação e findar a sua capacidade proliferativa no período correto do desenvolvimento animal. O sistema nervoso central da Drosophila trata-se de um modelo ideal para estudar o desenvolvimento, pelo conhecimento existente acerca dos mecanismos de regulação que nele ocorrem e pelas ferramentas genéticas disponíveis para a sua manipulação em laboratório. A Drosophila é um inseto halometabólico, cujo ciclo de vida compreende uma fase de embrião e três instares larvares. Sensivelmente ao sexto dia, o animal sofre metamorfose e transita para a fase de pupa, atingindo a fase adulta apenas ao décimo dia de desenvolvimento. Em Drosophila, as células estaminais neuronais denominam-se de neuroblastos. Os neuroblastos delaminam da neuroectoderme entre o estadio 9 e 11 do embrião. Neste estadio, iniciam a sua capacidade proliferativa, dividindo-se assimetricamente para gerar uma célula a ele semelhante, e uma célula-filha mais pequena, que mais tarde se dividirá em duas células neuronais diferenciadas (neurónios ou células glia). Nesta fase embrionária, dá-se origem à primeira onda da neurogénese. Após este período, alguns neuroblastos entram em apoptose, enquanto outros entram num período de senescência. Já em estado larvar, os neuroblastos que permaneceram readquirem a sua capacidade proliferativa, sendo que é nesta fase que cerca de 90% dos neurónios presentes no sistema nervoso central (CNS) do adulto são formados. Após a entrada no estadio de pupa, os neuroblastos vão gradualmente reduzindo o seu tamanho, até desaparecer, não se encontrando já presentes na fase adulta do animal. No CNS da Drosophila são possíveis encontrar dois tipos de neuroblastos: neuroblastos tipo I e neuroblastos tipo II. Os neuroblastos tipo I dividem-se assimetricamente para gerar uma célula maior, que dará origem a um novo neuroblasto, e uma célula-filha, mais pequena e diferenciada, denominada célula materna gangliar (GMC). Esta GMC dividir-se-á uma vez para gerar duas células neuronais diferenciadas, sejam elas neurónios ou células glia. Por sua vez, nos neuroblastos tipo II, o neuroblasto divide-se assimetricamente para gerar um novo neuroblasto e um progenitor neuronal intermédio (INP). Também os INPs gerados apresentam uma capacidade de divisão assimétrica, gerando um novo INP e uma GMC, que por sua vez voltará a formar duas células neuronais diferenciadas. Por cada INP formado, são geradas cerca de 6 GMCs, fazendo com que a linhagem celular proveniente dos neuroblastos tipo II sejam maiores. A divisão assimétrica é garantida pela correta localização celular de proteínas apicais e proteínas basais. As proteínas apicais, como por exemplo as compreendidas no complexo Par, são mantidas na célula que permanecerá um neuroblasto, enquanto que as proteínas basais (i.e. Miranda) serão herdadas pela célula filha, que se tornará mais diferenciada. Ao longo do desenvolvimento, os neuroblastos são também acompanhados pela expressão de uma cascata temporal de fatores de transcrição. Estes irão ser herdados pela célula-filha, em parte com o auxilio das proteínas basais, e conferir a identidade celular dos neurónios formados. O primeiro fator de transcrição, Hunchback, começa a ser expresso na fase embrionária, seguido depois por Seven-up, Kruppel, Pdm1/2 e Castor. Depois de Castor, os neuroblastos entram em quiescência e, já no primeiro instar larvar, apenas os neuroblastos positivos para Castor voltam a entrar no ciclo celular, transitando mais tarde para a expressão de Seven-up. Depois de Seven-up, não foram identificados subsequentes fatores de transcrição. O processo de diminuição do tamanho dos neuroblastos e o tempo do desenvolvimento em que a sua saída do ciclo celular ocorre são fatores essências para garantir que o os neurónios adquirem uma correta identidade, e que são formados em correto numero. De facto, desregulações neste processo estão por detrás de doenças neurológicas ou formação de tumores. Um dos mecanismos regulatórios por detrás da proliferação e diferenciação de células estaminais são as modificações epigenéticas, tais como as remodelações de cromatina. Nas células estaminais, a transição de um estado de pluripotência para um estado mais diferenciado é acompanhado por mudanças gerais ao nível da estrutura da cromatina. Para a mudança no estado de diferenciação é necessária a ação de mecanismos regulatórios de cromatina para permitir que os genes associados à pluripotência sejam gradualmente silenciados enquanto que outros genes específicos da linhagem da célula diferenciada sejam ativados. Tradicionalmente, a conformação da cromatina está associada à atividade transcriptional daquela região génica, de modo a que genes presentes num ambiente de cromatina densa estejam menos propensos à transcrição e genes em ambientes de cromatina mais liberta sejam mais transcripcionalmente ativos. Do mesmo modo, as células estaminais dispõem uma estrutura de cromatina mais aberta e permissiva, de acordo com o seu estado de pluripotência, em contraste com as células mais diferenciadas. Esta reorganização na estrutura de cromatina durante o processo de diferenciação acontece, pelo menos em parte, através de uma alteração dinâmica de proteínas estruturais, como é o caso das histonas (e, a um nível mais global, os nucleossomas). Envolvidos neste processo estão duas principais classes de enzimas remodeladoras: aquelas que usam a hidrólise de ATP para alterar os contactos histona-DNA e aquelas que modificam covalentemente as histonas. Alguns complexos são capazes até de reunir enzimas de ambas as categorias. A remodelação de cromatina pode, por exemplo, ser regulada por vias de sinalização celular, que irão regular que porção do DNA deverá encontrar-se exposta, de modo a facilitar ou reprimir a interação com fatores regulatórios. Com este tipo de propriedades, os remodeladores de cromatina contribuem para a extremamente especifica regulação temporal da expressão génica, que acontece ao longo da diferenciação e de forma específica para cada tipo de célula, revelando-se um elemento essencial para a regulação das células estaminais. A interação de reguladores de cromatina com fatores de transcrição apresenta também um papel importante na regulação da pluripotência. Habitualmente a cromatina age como um moderador dos níveis necessários para a ativação da transcrição génica de forma a limitar o ruido transcriptional. Os complexos repressores de cromatina são essenciais para o estabelecimento da identidade celular durante o desenvolvimento do tecido, ao restringirem a expressão de importantes reguladores do ciclo celular e genes chave para o desenvolvimento. As células estaminais estão cercadas por múltiplos sinais e a perda de remodeladores de cromatina faz com que a sensibilidade para estes diminua, alterando a ativação ou repressão génica e resultando em defeitos na diferenciação celular e desenvolvimento do organismo. Uma anterior análise a neuroblastos revelou que certos remodeladores de cromatina tinham um papel na sua regulação. Neste estudo propus-me a estudar o efeito de um regulador de cromatina nos processos de proliferação e diferenciação dos neuroblastos. Foi-me ainda possível testar alguns dos genes regulados por este remodelador de cromatina, de modo a melhor compreender o seu mecanismo de ação. De um modo geral, este estudo trata-se de um contributo para a melhor entendimento do envolvimento dos mecanismos epigenéticos na modulação dos genes envolvidos na regulação e diferenciação das células estaminais.The studies presented in this thesis were performed in the Proliferation and Fate Regulation of Stem Cells Lab, at the Center of Chronic Diseases (CEDOC) | NOVA Medical School, Universidade Nova de Lisboa, under the orientation of Catarina Homem, PhD