Untersuchungen zur Synthese der extrazellulären Matrix bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen

Prante C. Untersuchungen zur Synthese der extrazellulären Matrix bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2006.Proteoglykane bilden einen wichtigen Bestandteil der extrazellulären Matrix (ECM). An der Biosynthese der Glykosaminoglykan(GAG)-Ketten sind eine Vielzahl von Glykosyltransferasen beteiligt, wobei die Xylosyltransferase I (XT-I), durch den Transfer von Xylose auf spezifische Serinreste des Proteoglykan-Core-Proteins, die Synthese des Tetrasaccharid-Linkers initiiert. Für das zur XT-I hoch homologe Protein, Xylosyltransferase II (XT-II), konnte bislang keine physiologische Funktion nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte erstmals eine detaillierte Analyse zur Funktion und Regulation der XT-I bei pathophysiologischer Remodellierung der ECM. Anhand von humanen Herzgewebeproben konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) neben einer gesteigerten Expression des Enzyms auch eine vermehrte Deposition von GAG-Ketten und Proteoglykanen im Myokard aufweisen. Durch die Verwendung eines Modellsystems zur in vitro-Simulation der DCM konnte erstmals nachgewiesen werden, dass eine Hochregulation der XT-I-Expression durch mechanischen Stress erfolgt. Als Induktor der XT-I-Genexpression wurde TGF-[beta]1 identifiziert, welcher bei mechanischer Expansion kardialer Fibroblasten vermehrt sezerniert wird. Durch den Einsatz spezifischer Inhibitoren der TGF-[beta]1-Signalkaskade konnte nachgewiesen werden, dass die Regulation der XT-I-Transkription über den Signalweg der p38-MAP-Kinase reguliert wird. Über eine gezielte siRNA-vermittelte Degradierung der XT-I-mRNA in kardialen Fibroblasten sowie anschließende Quantifizierung des GAG-Gehalts im Zellkulturüberstand konnte zudem erstmals bestätigt werden, dass die XT-I das geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der kardialen GAG-Biosynthese darstellt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Vielzahl von Real-Time PCR-Systemen zur relativen Quantifizierung der mRNA-Expression der an der Proteoglykan-Biosynthese beteiligten Enzyme und Core-Proteine etabliert. Unter Verwendung dieser Systeme konnte umfassend die Regulation der Genexpression bei der physiologischen Ausbildung der ECM während der chondrogenen und osteogenen Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen untersucht werden. Die Expressionsanalyse zeigte, dass sowohl die GAG-bildenden Enzyme als auch die Proteoglykan-Core-Proteine vielfach die gleichen Regulationsmuster aufweisen. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass sowohl bei Chondrogenese als auch bei Osteogenese die XT-I, aufgrund einer den anderen Enzymen vorgelagerten Expression, vermutlich eine Schlüsselposition bei der Assemblierung der GAG-Ketten einnimmt. Für die XT-II wurde bei beiden Differenzierungswegen jeweils eine zur XT-I differierende Expressionskinetik detektiert. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Analyse der Expression von Schlüsselenzymen und Core-Proteinen der Proteoglykanbiosynthese eine Möglichkeit darstellt, die unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Stammzelldifferenzierung zu kategorisieren. Durch die Verwendung von shRNA und siRNA wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals die mRNA-Expression beider humaner Xylosyltransferasen gezielt in vitro um mehr als 80 Prozent reduziert. Durch die siRNA-vermittelte Reduktion der XT-I- und XT-II-mRNA-Expression in SW1353- und SAOS2-Zellen konnte dadurch erstmals nachgewiesen werden, dass die XT-II eine Xylosyltransferaseaktivität aufweist. Zusätzlich zeigte sich, dass die XT-II in aktiver Form in den Zellkulturüberstand sezerniert wird und dort eine, im Vergleich zur XT-I, abweichende Akzeptorspezifität aufweist. Darüber hinaus wurde bei der Regulation beider Xylosyltransferasen ein Rückkopplungsmechanismus detektiert. So konnte nachgewiesen werden, dass bei einer singulären Reduktion eines der beiden Enzyme eine vermutlich kompensatorische Hochregulation des jeweils anderen Enzyms erfolgt