Molekulare Charakterisierung einer in Escherichia coli exprimierten cytosolischen Sialidase aus CHO-Zellen

Burg M. Molekulare Charakterisierung einer in Escherichia coli exprimierten cytosolischen Sialidase aus CHO-Zellen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2001.In Produktionsprozessen mit CHO-Zellen wird bei hohen Zelldichten durch Zellyse cytosolische Sialidase freigesetzt. Bei der cytosolischen Sialidase aus CHO-Zellen handelt es sich um ein Enzym, das humane, rekombinante Glykoproteine postsekretorisch desialylieren kann. Die terminalen Sialinsäuren N-glykosidisch gebundener Oligosaccharidketten an Glykoproteinen werden dabei abgespalten. Für Glykoproteine zum Einsatz in der Humantherapie ist die korrekte Sialylierung dieser Oligosaccharidketten relevant für die Verweildauer der Proteine im Blutkreislauf. Desialylierte Glykoproteine binden an Rezeptoren der Leber und werden abgebaut. Dadurch ist die biologische Halbwertszeit dieser Glykoproteine im Vergleich zu den vollständig sialylierten deutlich herabgesetzt. In Geweben und in Zellkulturüberständen ist die cytosolische Sialidase nur in geringen Konzentrationen vorhanden, so dass durch biochemische Aufreinigungsmethoden bisher lediglich Sialidasemengen im Mikrogrammbereich isoliert werden konnten. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Klonierung und Expression der cytosolischen Sialidase in E. coli, und zwar in Form eines löslichen und aktiven Fusionsproteins. Die nachfolgende Produktion im 25 Liter Maßstab ermöglichte die Isolierung des Sialidase-Fusionsproteins im Milligrammbereich. Abschließend wurden die Sialidaseaktivität und -spezifität des produzierten Enzyms charakterisiert und ein polyklonales Antiserum gegen das Sialidase-Fusionsprotein hergestellt. Sialidase cDNA konnte mittels RT PCR amplifiziert werden. Durch den Einsatz der degenerierten Primer wurden Sialidase cDNA RT PCR-Produkte mit verschiedenen Schnittstellen zur Klonierung synthetisiert. Die RT PCR-Produkte, die an den Enden jeweils mit unterschiedlichen Schnittstellen versehen waren, wurden in pCR 2.1 Vektoren subkloniert. Zur Produktion eines Sialidase-Fusionsproteins wurde ein pGEX Expressionsvektor ausgewählt. Die Klonierung in den Expressionsvektor pGEX-2T war erfolgreich. Aus 6 von 20 untersuchten Klonen konnten Plasmide mit Sialidase cDNA isoliert werden. Die Expression der Sialidase-Fusionsproteine wurde durch Zugabe von IPTG zu den Kulturansätzen der Klone mit pGEX-2T Vektor, in denen das Sialidase-Insert nachgewiesen werden konnte, induziert. Ein GST-Sialidase Fusionsprotein konnte mit dem pGEX-2T Expressionsvektor exprimiert werden. Die exprimierte GST-Sialidase wurde mit Glutathion Sepharose isoliert und die Sialidaseaktivität in den Lysaten der Klone nachgewiesen. Die GST-Sialidase wurde im Bioreaktor (Fermentation 1 und Fermentation 2) produziert und dann mittels Glutathion Sepharose Affinitätschromatographie aufgereinigt. Aus 25 Liter Kulturvolumen der Fermentation 1 wurden nach 2 h 30 min Induktion mit 0,1 mM IPTG bei 25°C 26,46 mg mit einer spezifischen Aktivität von 0,999 U / mg Protein aufgereinigt. Aus Fermentation 2 konnten nach 3 h 10 min Induktion mit 1 mM IPTG bei 25°C 13,8 mg Protein mit einer spezifischen Aktivität von 0,891 U / mg Protein aufgereinigt werden. Die affinitätsgereinigte GST-Sialidase aus Fermentation 1 wurde mittels Q Sepharose FF Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration nachgereinigt, um ein hochreines Produkt zur Immunisierung herzustellen. Die Enzymaktivität der affinitätsgereinigten Sialidase aus Fermentation 2 wurde biochemisch mit Hilfe der Inhibitoren Neu5Ac und Neu5Ac2en untersucht. Durch 2 mM Neu5Ac wurde die Aktivität von 0,203 mU GST-Sialidase um ca. 20 v.H. reduziert. Bei einer Konzentration von 0,5 mM Neu5Ac2en konnte eine Verringerung der Aktivität von 0,203 mU GST-Sialidase um ca. 75 v.H. gemessen werden. Neu5Ac2en hemmt die Sialidaseaktivität sehr viel effektiver als Neu5Ac. Die Spezifität der affinitätsgereinigten GST-Sialidase aus Fermentation 2 wurde mit Hilfe von Gangliosiden aus humanen Granulozyten untersucht. Granulozyten Ganglioside besitzen Lipid-gebundene terminal sialylierte Neolacto-Typ II-Oligosaccharid-Sequenzen, die auch Protein-gebunden in Glykoproteinen vorkommen. Die Spezifitäten von V. cholerae Neuraminidase und der GST-Sialidase gegenüber den Substraten wurden miteinander verglichen. Beide Enzyme sind in der Lage, sowohl [alpha](2,3)- als auch [alpha](2,6)-sialylierte Neolactoserie-Ganglioside zu hydrolysieren. Die GST-Sialidase zeigte im Gegensatz zur V. cholerae Neuraminidase eine deutliche Präferenz gegenüber [alpha](2,3)-sialylierten Neolactoserie-Gangliosiden. Hochreine GST-Sialidase wurde als Antigen eingesetzt, um in Hühnern polyklonale Antikörper herzustellen. Das hergestellte Immunserum lässt sich für den spezifischen Nachweis der GST-Sialidase einsetzen