The expression of stem cell markers, SF1 and DAX1 in the human adrenal cortex development and its association with the Wnt/beta-catenin pathway in adrenocortical tumorigenesis

Introdução: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) e a via Wnt controlam o desenvolvimento de células progenitoras/tronco adrenais. NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3 estão envolvidos na manutenção de células-tronco e têm papel em vários cânceres de diferentes tecidos. Ainda não está claro se esses fatores de transcrição interagem para promover a tumorigênese adrenocortical. Objetivo: Nos tumores adrenocorticais (TAC): avaliar o ganho de material genômico e a expressão de RNAm e proteica de DAX1 e SF1; avaliar a expressão de RNAm e proteica de marcadores de células-tronco (NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3). No desenvolvimento do córtex adrenal: avaliar a expressão proteica desses genes. In vitro: avaliar a interação entre a via Wnt/Beta-catenina e a expressão de NANOG. Pacientes e Métodos: Painel de 30 córtices adrenais fetais humanos (20-38 semanas de gestação) e 14 pós-natais. Pacientes com TAC: 96 crianças/adolescentes (81% do sexo feminino, idade mediana de 1,6 anos [0,4 a 15,6 anos]) e 18 adultos (10 adenomas e 8 carcinomas, 89% do sexo feminino e idade mediana de 42,5 anos [21-66 anos]). Tecidos adrenais normais (controles para qPCR e MLPA): 13 crianças (idade mediana de 3 anos) e 13 adultos (mediana de idade de 48 anos). A expressão proteica de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 foi avaliada por imunohistoquímica nos TAC e nos córtices adrenais fetais e pós-natais. A expressão de RNAm de NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG e POU5F1 (OCT4) foi avaliada por qPCR nos TAC. Ganho ou perda de material genômico de NR0B1 e NR5A1 foi avaliada por MLPA nos TAC. In vitro, a expressão de NANOG (qPCR) foi avaliada em células adrenais H295 antes e após inibição da via Wnt/Beta-catenina com a substância PNU-74654. Resultados: Em adrenais fetais com 20 e 25 semanas de gestação detectou-se marcação intensa de SF1, DAX1, SOX2 e OCT4 na região subcapsular e marcação leve a moderada e difusa de STAT3 e NANOG. Após as 31 semanas e no período pós-natal, a marcação intensa de SF1 persistiu, porém a marcação de DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 diminuiu ou desapareceu. Nos TAC, a marcação nuclear de SF1 foi positiva em 67% das amostras pediátricas e em 19% das amostras de adultos. Ganho de material genômico do NR5A1 foi observado em 71% dos TAC pediátricos e 33% de TAC adultos. Porém observou-se hipoexpressão do RNAm do NR5A1 em 84% dos TAC pediátricos. Nenhum ganho de material genômico ou aumento da expressão do RNAm do NR0B1 foi observado nos TAC pediátricos. Porém em 45% desses tumores detectou-se marcação nuclear. Nos TAC de pacientes adultos, houve aumento da expressão de RNAm de NR0B1 em 89% das amostras. Não se observou marcação de STAT3 nos TAC pediátricos e adultos. Porém nos pacientes adultos, a expressão do RNAm de STAT3 foi significativamente maior nos adenomas do que nos carcinomas. Por sua vez, a marcação nuclear do OCT4 associou-se significativamente com a ocorrência de metástases nos pacientes pediátricos. Nos TAC com a mutação p.S45P no gene da Beta-catenina detectou-se expressão significativamente aumentada do RNAm do NANOG. Além disso, após a inibição in vitro da via Wnt/Beta-catenina nas células tumorais adrenais houve redução significativa na expressão do RNAm de NANOG. Conclusão: Existe um padrão temporal na expressão de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 durante o desenvolvimento do córtex adrenal fetal, porém apenas a expressão de SF1 permanece no final da gestação e após o nascimento. TAC pediátricos exibem ganho de material gênico, aumento da expressão proteica e aparentemente redução paradoxal do RNAm do SF1 (NR5A1). Marcação nuclear de OCT4 se associa a fenótipo tumoral mais agressivo nos pacientes pediátricos. Parece exisitir interação entre a via Wnt/Beta-catenina e células-tronco, por meio do fator de transcrição NANOG, na tumorigênese adrenocortical.Background: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) and the Wnt pathway control adrenal stem/progenitor cells development. NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3 are involved in the maintenance of stem cells and have role in various types of cancers in different tissues. It is still unclear whether these transcription factors interact to promote adrenocortical tumorigenesis. Objective: In adrenocortical tumors (ACT): to evaluate the gain of genomic material and the expression of mRNA and protein of DAX1 and SF1; to evaluate the mRNA and protein expression of stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3). In the development of the adrenal cortex: to evaluate the protein expression of these genes. In vitro: to evaluate the interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and NANOG expression. Patients & Methods: Panel of 30 fetal human adrenal cortices (20-38 gestational weeks) and 14 postnatal human adrenal cortices. ACT Patients: 96 children/ teenagers (81% female; median age of 1.6 years; 0.4-15.6 years) and 18 adults (10 adenomas and 8 carcinomas; 89% female; median age of 42.5 years; 21-66 years). Normal adrenal tissues (qPCR and MLPA controls): 13 children (median age of 3 years) and 13 adults (median age of 48 years). Protein expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 was assessed by immunohistochemistry in ACT, fetal and postnatal adrenal cortices. The mRNA expression of NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG and POU5F1 (OCT4) was assessed by qPCR in ACT. Gain or loss of NR0B1 and NR5A1 genomic material was assessed by MLPA in ACT. In vitro, NANOG expression (qPCR) was evaluated in H295 adrenal cells before and after inhibition of the Wnt/Beta-catenin pathway with PNU-74654. Results: In the adrenal glands at 20 and 25 gestational weeks, intense staining of SF1, DAX1, SOX2 and OCT4 was detected in the subcapsular region and a diffuse pattern mild to moderate staining of STAT3 and NANOG. After 31 weeks and in the postnatal period, intense SF1 staining persisted, but the staining of DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 decreased or disappeared. In the ACT, the nuclear staining of SF1 was positive in 67% of pediatric samples and in 19% of adult samples. Gain of NR5A1 genomic material was observed in 71% of pediatric ACT and 33% of adult ACT. However, hypoexpression of NR5A1 mRNA was observed in 84% of pediatric ACT. No gain of genomic material or increase in mRNA expression of NR0B1 was observed in pediatric ACT. However, in 45% of these tumors nuclear staining was detected. In adult ACT, there was an increase in NR0B1 mRNA expression in 89% of the samples. No STAT3 staining was found in pediatric and adult ACT. However, in adult ACT, the STAT3 mRNA expression was significantly higher in adenomas than in carcinomas. In turn, the nuclear marking of OCT4 was significantly associated with the occurrence of metastases in pediatric patients. In the TACs with the p.S45P mutation in the Beta-catenin gene significantly increased NANOG mRNA expression was detected. In addition, after in vitro inhibition of the Wnt / Beta-catenin pathway in adrenal tumor cells there was a significant reduction in NANOG mRNA expression. Conclusion: There is a temporal pattern in the expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 during the development of the fetal adrenal cortex, but only SF1 expression remains at the end of gestation and after birth. Pediatric ACT show gain in NR5A1 gene material, increase in its protein expression but an apparent paradoxical reduction of mRNA. Nuclear staining of OCT4 is associated with more aggressive tumor phenotype in pediatric patients. There appears to be an interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and stem cells via NANOG, in adrenocortical tumorigenesis