Untersuchungen zu Regulatoren der Flavonoidbiosynthese in Arabidopsis thaliana : eine Studie zu neuen Funktionen bekannter Proteinklassen

Huep G. Untersuchungen zu Regulatoren der Flavonoidbiosynthese in Arabidopsis thaliana : eine Studie zu neuen Funktionen bekannter Proteinklassen. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2008.The biosynthesis of flavonoids in Arabidopsis thaliana can be interpreted as a model system for the regulation of gene expression and metabolism in plants. The flavonoids can be subdivided into flavonols, anthocyanins and proanthocyanidins. A majority of the transcription factors, which are involved in the developmental and tissue specific accumulation of these metabolites, is well known. In this work a number of regulators of the flavonoid metabolism was analysed in detail. Each of these regulators was mainly involved in the biosynthesis of one of the three subclasses of flavonoids. Either new functions of the regulators could be observed or tools for further investigations concerning their functions were generated. The C2H2 zinc finger protein TT1 was analysed as an example for a regulator of the seed coat specific proanthocyanidin accumulation. A stable knock out of the tt1 gene was generated using a transposon insertion line and the previously assumed tt1 knock out phenotype was confirmed. A number of new TT1 alleles was identified by the TILLING method. Those alleles are now available for the molecular characterisation of TT1. Moreover five homologues of TT1, which form the WIP gene family in A. thaliana together with TT1, were analysed concerning expression profiles, intracellular localisation, knock out and overexpression phenotypes and possible target genes. In tt1 proanthocyanidins are mainly found in the micropylar and chalazal area of the seeds. To analyse this tissue specific accumulation in more detail, a population of EMS mutagenised tt1 plants was generated. This population is available now for further investigations, which could lead to new insights in the molecular function of TT1 or in the different regulation of gene expression in the micropylar and chalazal areas of the seed. The PFG genes encode the R2R3-MYB transcription factors MYB11, MYB12 and MYB111, which are flavonol specific regulators. They are known to activate some genes, which are encoding enzymes of the flavonoid metabolism, like for example CHS and FLS. There were hints for further candidate target genes, resulting from ATH1 gene chip analysis. In this work three of these candidate target genes could be confirmed experimentally by using co-transfection assays. Besides R2R3-MYB transcription factors R3-MYB proteins are found in A. thaliana. An involvement in processes leading to the determination of the cell identity of trichomes and root hairs has been shown for several R3-MYBs. In this work a negatively regulating effect of the R3-MYB protein MYBL2 on the activation of the DFR gene, which is involved in anthocyanin formation, has been shown. This is the first known example of an R3-MYB gene, which is involved in flavonoid metabolism in plants.Der Flavonoidmetabolismus in Arabidopsis thaliana kann als Modellsystem zum Verständnis der Regulation von Genexpression und Stoffwechsel in Pflanzen aufgefasst werden. Als Endprodukte der Flavonoidbiosynthese werden Flavonole, Anthocyane und Proanthocyanidine gefunden. Viele der Transkriptionsfaktoren, die an der entwicklungs- und gewebespezifischen Akkumulation dieser Metabolite beteiligt sind, sind bereits charakterisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden exemplarisch Regulatoren, die jeweils die Biosynthese einer der drei Flavonoidklassen beeinflussen, detailliert untersucht. Hierbei konnten für sie entweder bislang unbekannte Funktionen beobachtet werden oder Hilfsmittel für ihre weiterführende Analyse bereitgestellt werden. Als Regulator der samenschalenspezifischen Proanthocyanidinakkumulation wurde das C2H2-Zinkfingerprotein TT1 behandelt. Es wurde unter Verwendung einer Transposon-Insertionslinie ein stabiler knock out des tt1-Gens generiert und der vermutete knock out Phänotyp bestätigt. Eine Reihe neuer TT1-Allele wurde durch TILLING identifiziert, die nun zur molekularen Charakterisierung von TT1 zur Verfügung stehen. Weiterhin wurden fünf zu TT1 homologe Gene, die zusammen die WIP-Genfamilie in A. thaliana bilden, hinsichtlich Expressionsmuster, intrazellulärer Lokalisation, knock out und Überexpressionsphänotypen sowie möglicher Zielgene untersucht. Weiterhin wurde die auch im tt1 knock out spezifisch in den Samengeweben Mikropyle und Chalaza stattfindende Proanthocyanidinsynthese analysiert. Hierzu wurde eine Population EMS-mutagenisierter tt1 Pflanzen aufgebaut. Diese steht nun für weiterführende Untersuchungen zur Verfügung, die einerseits Hinweise zur molekularen TT1-Funktion liefern könnten und andererseits die Aufklärung der vom restlichen Samengewebe abweichenden Regulation der Flavonoidbiosynthese in Mikropyle und Chalaza ermöglichen könnten. Die von den PFG-Genen kodierten R2R3-MYB-Transkriptionsfaktoren MYB11, MYB12 und MYB111 stellen flavonolspezifische Regulatoren der Flavonoidbiosynthese dar. Einige Strukturgene des Flavonoidstoffwechsels wie beispielsweise CHS oder FLS werden von ihnen aktiviert. Weitere Zielgene wurden aufgrund von ATH1-Genchip-Analysen angenommen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit A5g62210, At2g22590 und At4g15480 drei dieser weiteren Zielgene durch Ko-Transfektionsexperimente experimentell bestätigt werden. Neben R2R3-MYB-Transkriptionsfaktoren werden in A. thaliana R3-MYB-Proteine gefunden. Für eine Reihe von ihnen wird üblicherweise eine Beteiligung an der Zelldifferenzierung zu Trichom- oder Wurzelhaarzellen gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte für das R3-MYB-Protein MYBL2 ein negativer Einfluss auf die Aktivierung des an der Anthocyanbiosynthese beteiligten Gens DFR nachgewiesen werden und somit erstmalig eine Beteiligung eines R3-MYB-Gens am Flavonoidmetabolismus gezeigt werden