Tissue factor pathway inhibitor (TFPI)-1 und -2 : Analyse von Sequenzvariationen und ihre pathobiochemische Bedeutung

Siegling S. Tissue factor pathway inhibitor (TFPI)-1 und -2 : Analyse von Sequenzvariationen und ihre pathobiochemische Bedeutung. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2005.Tissue factor pathway inhibitor (TFPI)-1 und -2 sind Serinproteinase-Inhibitoren, die zur Kunitz-Typ-Familie gehören. Während die Funktion für TFPI-1 als zentraler Inhibitor des exogenen Weges der Blutgerinnung bekannt ist, ist die physiologische Bedeutung von TFPI-2 weiterhin unklar. Eine Beteiligung an Tumorinvasion, inflammatorischen Prozessen und Arteriosklerose wird vermutet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Klonierung der WT-TFPI-1-, [P151L]TFPI-1- und der WT-TFPI-2-cDNA gezeigt werden und es gelang die rekombinante Darstellung in einem COS-1-Säugerzell- und einem High Five-Insektenzell-Expressionsystem. Die Konzentration und die inhibitorische Aktivität des rWT-TFPI-1 und der r[P151L]TFPI-1-Mutante konnte im Gesamt-TFPI-ELISA und im chromogenen TFPI-Aktivitätstest quantitativ bestimmt werden. Die inhibitorische Aktivität des rWT-TFPI-2 im Zellkulturüberstand von COS-1- und High Five-Zellen wurde mit einer verminderten Chymotrypsin-Aktivität von 31 Prozent und 62 Prozent gezeigt. Eine antikoagulatorische Wirkung für rWT-TFPI-2 konnte mit einer modifizierten partiellen Thromboplastinzeit nachgewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit konnte die Methode der denaturierenden Hochdruckflüssigkeitschromatografie (DHPLC) für die TFPI-Gene etabliert werden. Es wurden juvenile Patienten nach ischämischem Schlaganfall (Apoplex) und Patienten nach einer Stent-Implantation auf krankheitsassoziierte Polymorphismen untersucht. Für beide Gene konnten Sequenzvariationen in den flankierenden Intronabschnitten detektiert werden, aber keine neuen SNPs (single nucleotide polymorphism) in den kodierenden Regionen. Erstmals konnten 7 neue Sequenzvariationen -567C>T, -546C>T, -353A>G, -167G>A, -161G>C, -47C>A und -18C>A in der Promotorregion des TFPI-2-Gens in juvenilen Apoplex-Patienten und Blutspendern identifiziert werden. Zwei Sequenzvariationen -546C>T und -18C>A sind in möglichen Bindungsstellen für die humanen Transkriptionsfaktoren Oct-1 und Sp-1 lokalisiert. Mit einem Promotortestsystem konnte der Einfluss der detektierten Sequenzvariationen auf die transkriptionelle Aktivität untersucht werden. Für die Analyse wurde das WT-TFPI-2-Promotorfragment (716 bp) stromaufwärts vom Translationsstart in einen secreted alkaline phosphatase (SEAP)-Expressionsvektor ohne eukaryotischen Promotor und Enhancer kloniert. Die Sequenzvariationen konnten mit gerichteter Mutagenese eingeführt werden. HEK-293-Zellen wurden mit dem Plasmid pSEAP2-Basic/WT-TFPI-2-PF und mit Plasmiden, die einen Nukleotidaustausch in der cDNA des WT-TFPI-2-Promotorfragments enthalten, transfiziert. Die SEAP-Expressionsrate im Zellkulturüberstand wurde bestimmt und es konnte gezeigt werden, dass die Promotoraktivität der getesteten Mutanten 1,3-2,8-fach reduziert war im Vergleich mit dem Wildtyp (pA, lokalisiert in einer möglichen Transkriptionsfaktorbindungsstelle für Sp-1, zeigte den größten Effekt auf die transkriptionelle Promotoraktivität