Relación de la producción de metabolitos y la actividad fenoloxidasa de líquenes del género Peltigera con sus comunidades bacterianas asociadas

Tesis Magíster en Bioquímica en el área de especialización de Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de BioquímicoLos líquenes son asociaciones simbióticas entre 2 o 3 organismos, entre los cuales hay siempre un hongo o micobionte y uno o dos fotobiontes. El fotobionte puede corresponder a un alga fotosintética o a una cianobacteria, y ambos están presentes en el caso de los líquenes tripartitos, donde el alga es el organismo fotosintético principal. En los cianolíquenes, la cianobacteria aporta los fotosintatos y además, con la fijación de nitrógeno atmosférico. Recientemente se ha descrito que los ensambles microbianos que se desarrollan formando biopelículas sobre el talo del liquen pueden ser considerados un componente adicional en estas simbiosis. Sin embargo, aún no se han definido el o los factores que determinan la estructura de dicha microbiota asociada. En general, los líquenes se caracterizan por poseer un metabolismo secundario muy activo, cuyos productos son principalmente compuestos fenólicos, obtenidos por diversas vías, como las del polimalonato, siquimato y mevalonato. Dada esta alta producción de metabolitos, se propone estudiar si la comunidad bacteriana asociada íntimamente al talo del cianoliquen Peltigera se relaciona con la diversidad de estos compuestos, aunque para este género de líquenes no se ha descrito una elevada producción de los mismos. Además, diversas actividades enzimáticas se han cuantificado en líquenes, y en el caso particular de Peltigera, las fenoloxidasas han sido las más estudiadas. Esta actividad podría estar relacionada con la estructuración de la comunidad bacteriana asociada al talo liquénico, ya que la generación de compuestos oxidantes se sugiere está asociada a defensa contra patógenos y propiedades antibióticas. Las 50 muestras de líquenes del género Peltigera y el sustrato asociado, provienen de dos bosques de la Reserva Nacional Coyhaique. Con el fin de identificar y agrupar filogenéticamente a los simbiontes muestreados, se obtuvieron las secuencias de los genes rRNA 18S y 28S de hongos y del gen del rRNA 16S de cianobacterias, a partir de los cuales se encontraron 6 haplotipos de micobionte y 5 de cianobionte, con los que se definieron las OTUs y 11 muestras compuestas. Por otra parte, los metabolitos de las muestras compuestas se analizaron usando técnicas de cromatografía en placa fina en dos dimensiones (TLC-2D), la actividad fenoloxidasa asociada a cada muestra liquénica compuesta se determinó espectrofotométricamente mediante el monitoreo de la oxidación del ácido 2'2-azino-bis-[3-etilbenzotiazol-6-sulfónico] (ABTS) a 436 nm. Finalmente, la estructura genética de la comunidad bacteriana relacionada a los líquenes y a los sustratos, se determinó mediante el uso de la técnica del polimorfismo en el largo de los fragmentos terminales de restricción (TRFLP), mientras que la estructura metabólica se determinó mediante los perfiles fisiológicos a nivel comunitario (CLPP) a través del uso de placas EcoPlate (BioLog®). Los perfiles genéticos y metabólicos fueron diferentes en su estructura dependiendo de la identidad de los simbiontes y el bosque del que provenían. Se encontraron correlaciones de la diversidad de metabolitos de los líquenes con la estructura genética de las comunidades asociadas a éstos y las presentes en el sustrato, y de la actividad fenoloxidasa de las muestras de líquenes con la estructura metabólica de la comunidad bacteriana obtenida desde el talo. Los resultados de esta tesis sugieren que tanto la producción de metabolitos como la actividad fenoloxidasa, ambos factores atribuibles al liquen, cumplirían un papel en determinar la diversidad genética y metabólica de la comunidad bacteriana asociada al talo de líquenes del género Peltigera y al sustrato donde ellos crecenLichens are symbiotic associations between 2 or 3 organisms, including a fungus and one or two photobionts. A photosynthetic algae or a cyanobacterium can be the photobiont in these associations, and both are present in tripartite lichens, where the algae is the main photosynthetic organism. In cyanolichens, the cyanobacterium provides with photosynthates and with atmospheric nitrogen fixation. Recently, it has been described that microbial assembles, that develop forming biofilms upon the lichen thallus, can be considered an additional component in these symbioses. However, the factors determining the structure of this associated microbiota have not yet been defined. In general, lichens are characterized by their very active secondary metabolism, whose products are mainly phenolic compounds obtained by different metabolic pathways, such as the polymalonate, shikimic acid and mevalonate ones. Given this high production of metabolites, it is propose to study if the bacterial community intimately associated to Peltigera cyanolichens thallus is related to the diversity of these compounds, even though this particular lichen genera has not been associated with a high production of these compounds. Moreover, different enzymatic activities have been quantified in lichens, and in the Peltigera particular case, phenoloxidases have been the more studied enzymes. This activity could be related with the structuration of lichen thallus associated bacterial community, because the production of oxidant compounds has been related to defense against pathogens and to antibiotic activities. The 50 lichen samples of the genus Peltigera and their corresponding associated substrates derived from two forests of the Coyhaique National Reserve. With the aim of identifying and phylogenetically grouping the sampled symbionts, sequences of fungal 18S and 28S rRNA and cyanobacterial 16S rRNA genes were obtained, from which 6 mycobiont and 5 cyanobiont haplotypes were found, defining the corresponding OTUs and 11 composite samples. On the other hand, metabolites of composite samples were analyzed using bi-dimensional thin layer chromatography (TLC-2D), whilst phenoloxidase activity of each lichen composite sample was spectrophotometrically determined by monitoring the oxidation of 2,2'-azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid] (ABTS) at 436 nm. Finally, genetic structures of the bacterial communities, related to lichens and substrates, were determined by terminal restriction fragment length polymorphism (TRFLP), while metabolic structures were determined by community-level physiological profiling, using EcoPlates (Biolog®). Genetic and metabolic profiles were different in structure, depending on the symbiont identity and the forest from where they derived. Correlations were founded between diversity of lichen metabolites and genetic structures of bacterial communities associated to both lichen and substrate, and between liche