Molecularly Imprinted Polymer Layer Using Navicula sp. Frustules As Core Material For Lysozyme Recognition

Polimer tercetak molekul (MIP) merupakan alternatif bahan pengenalan mantap dan kos efektif yang berpotensi untuk menggantikan antibodi dan enzim. MIP yang disediakan secara konvensional dengan melalui pencetakan pukal sentiasa menunjukkan akses tapak ikat yang lemah untuk molekul protein sasaran. Untuk mengatasi kelemahan ini, kerja-kerja penyelidikan telah dijalankan dengan menggunakan nanopartikel sebagai bahan teras untuk pencetakan protein. Kaedah ini telah meningkatkan akses cetakan serta kinetik ikatan kembali, tetapi kapasiti ikatan kembali yang dicapai masih rendah kerana lapisan polimer yang dihasilkan adalah sangat nipis, ia tidak dapat merangkumi keseluruhan protein dan kaviti pengenalan yang dihasilkan dalam lapisan polimer adalah terhad. Oleh itu, frustule diatom yang mempunyai luas permukaan yang lebih besar telah digunakan sebagai pengganti bahan teras bagi MIP untuk meningkatkan kapasiti ikatan kembali. Sehubungan itu, Navicula sp. frustule pertama kali digunakan sebagai bahan teras kerana sifat-sifat unik seperti kekuatan mekanik yang baik, nano struktur liang, bioserasi, kebolehasilan dengan tepat dalam jumlah yang besar dan mudah dimodifikasi, untuk menangani kelemahan nanopartikel. Dalam kajian ini, lapisan MIP telah disintesis atas Navicula sp. frustule dengan menggunakan akrilamida (AAM), asid metaakrilik (MAA) dan 2-dimetilamino etilmetakrilat (DMAEMA) sebagai monomer berfungsi. Lisozim (LYZ) telah digunakan sebagai cetakan kerana ia bertindak sebagai indeks penting dalam mengenal pasti pelbagai penyakit. Keadaan pempolimeran telah diperiksa dan keadaan yang optimum telah dicapai di peratusan berat pengikat silang pada 50 % dan nisbah molar monomer AAM/MAA/DMAEMA pada 1/0.5/0.5. Berdasarkan keputusan pengikatan kembali, MIP optimal telah menunjukkan peningkatan kapasiti ikatan kembali (124 ± 1.09 mg g-1) dan faktor tercetak (2.99) dengan kinetik ikatan kembali yang cepat (15 minit) berbanding dengan kerja-kerja penyelidikan yang menggunakan nanopartikel sebagai bahan teras. Keputusan juga menunjukkan afiniti MIP terhadap LYZ adalah 2.32 kali lebih tinggi daripada Cyt C and 8.87 kali lebih tinggi daripada BSA. Ini mengesahkan bahawa konformasi dan konfigurasi kaviti pengenalan yang dibentuk dalam MIP adalah sepadan dengan cetakan LYZ. MIP ini juga boleh digunakan semula sekurang-kurangnya 5 kitaran berulang melalui pembasuhan ringan dengan 0.5 M NaCl, ini mencadangkan LYZ berinteraksi dengan MIP secara bukan kovalen. Interaksi protein dan MIP juga dikaji dengan analisis Ektensi Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (XDLVO), dan analisis ini menunjukkan bahawa interaksi van der Waals, elektrostatik dan sterik memainkan peranan yang penting dalam penjerapan protein atas MIP. Interaksi menarik yang diramalkan adalah kurang daripada -1.693 kT, dan ini mencadangkan bahawa penjerapan LYZ atas MIP adalah lemah dan mudah terganggu. Selain itu, pengikatan LYZ terhadap MIP dalam larutan campuran protein juga dilakukan. Kajian ini menunjukkan bahawa MIP dapat membezakan LYZ daripada protein bersaing apabila terdedah dalam larutan yang mempunyai pelbagai pH atau larutan yang mempunyai protein bersaing dalam kepekatan yang tinggi. Akhir sekali, MIP telah digabungkan dengan fluorofor (FITC-MIP) untuk meningkatkan utiliti MIP sebagai potensi unsur pengenalan biosensor. FITC-MIP yang dibangunkan dapat mengukur LYZ dalam julat kepekatan antara 0 hingga 0.025 mg mL-1, dengan had pengesanan rendah pada 0.0015 mg mL-1 dan respon pengesanan dicapai dalam masa 30 minit. Prestasi pengenalan dan pengikatan kembali yang cemerlang mencadangkan Navicula sp. frustules adalah bahan teras yang baik bagi lapisan polimer tercetak protein dan mempunyai aplikasi dalam bioperubatan dan diagnostik. ________________________________________________________________________________________________________________________ Molecularly imprinted polymer (MIP) is a robust and cost-effective recognition material with the potential to replace antibody and enzyme. Conventionally, MIP prepared via bulk imprinting method usually showed poor binding site accessibility for targeted protein molecules. To overcome this drawback, significant amount of research works have been carried out using nanoparticles as core material for protein imprinting. This method has improved the template accessibility as well as rebinding kinetics, but the rebinding capacity achieved is still relatively low owing to the polymer layer generated is extremely thin which was not able to encapsulate the entire protein and the recognition cavities generated therein is limited. Hence, diatom frustules with higher surface were used as replacement of core material for MIP in order to improve rebinding capacity. In this regard, Navicula sp. frustules were used for the first time as core material due to their unique properties of good mechanical strength, nanostructure pores, biocompatible, reproducible with exactness in massive number, and easy to functionalize in order to address the limitation of nanomaterials. In this study, the MIP layer was synthesized on Navicula sp. frustules using acrylamide (AAM), methacrylic acid (MAA), and 2-dimethylamino ethylmethacrylate (DMAEMA) as functional monomers. Lysozyme (LYZ) was used as template to be imprinted as it acts as important index in the diagnosis of various diseases. The polymerization conditions were examined and the optimal conditions were attained at percentage of crosslinker of 50 wt % and monomers molar ratio AAM/MAA/DMAEMA of 1/0.5/0.5. Based on rebinding result, this optimal MIP exhibited enhancement in both rebinding capacity (124 ± 1.09 mg g−1) and imprinting factor (2.99) with a rapid rebinding kinetic (15 minutes) when compared to other researchers that use nanoparticle core material. The result also demonstrated that affinity of MIP towards LYZ is 2.32 times higher than Cyt C and 8.87 times higher than BSA. This confirmed that conformation and configuration of recognition cavities created in MIP matches with template LYZ. The MIP could also be regenerated and reused at least 5 repeated cycles via mild washing with 0.5 M NaCl which suggested that LYZ interact non-covalently with MIP. This protein-MIP interaction was further investigated by extended Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (XDLVO) analysis which indicated that van der Waals, electrostatic and steric interactions played dominant role in dictating the adsorption of protein on MIP. The predicted attractive interaction of less than -1.693 kT suggested that LYZ adsorption onto MIP is generally weak and could be disrupted easily. Apart from these, the practicability of MIP to rebind LYZ in protein mixture solution was also performed. The test demonstrated that MIP is able to discriminate LYZ from competing proteins when exposed to various pH solution or solution with high concentration of competing protein. Lastly, the MIP was incorporated with fluorophore (FITC-MIP) to enhance the utility of MIP as potential recognition element for biosensor. The developed FITC-MIP was able to quantify LYZ within concentration range of 0 to 0.025 mg mL-1 with a lower limit of detection of 0.0015 mg mL-1 and a response time within 30 minutes. The outstanding recognition and rebinding performance suggested that Navicula sp. frustule is a good core material for protein imprinted polymer layer which and has promising application in biomedical and diagnostics