Isolierung und Charakterisierung der humanen UDP-D-Xylose: Proteoglykan-Core-Protein [beta]-D-Xylosyltransferase

Kuhn J. Isolierung und Charakterisierung der humanen UDP-D-Xylose: Proteoglykan-Core-Protein [beta]-D-Xylosyltransferase. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2000.UDP-D-Xylose: Proteoglykan-Core-Protein [beta]-D-Xylosyltransferase (EC 2.4.2.16, XT) initiiert die Biosynthese von Glykosaminoglykan-Seitenketten in Proteoglykanen durch den Transfer der Xylose von UDP-Xylose auf spezifische Serinreste des Core-Proteins. Die meisten Glykosyltransferasen, die an der Biosynthese der Glykosaminoglykane beteiligt sind, wurden bereits isoliert und charakterisiert. Dagegen war die Aminosäuresequenz und Struktur der XT bisher völlig unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Enzym erstmals isoliert und charakterisiert. Die Aufreinigung der XT wurde bisher aus tierischem Gewebe versucht. XT im Zellkulturüberstand zeichnet sich dagegen durch eine größere Reinheit aus. Hierzu wurde die Enzymaktivität im Überstand diverser Zelllinien mit Hilfe eines neuen radiochemischen XT-Tests gemessen. Dabei zeigte sich eine besonders hohe XT-Bildungsrate für JAR-Choriokarzinom-Zellen. Es gelang die Adaption dieser Zellen an eine serumfreie Kultivierung, die zu einer 19fachen Steigerung der spezifischen XT-Aktivität im Zellkulturüberstand führte. Darüber hinaus konnte ein Zellkultivierungssystem entwickelt werden, bei dem JAR-Choriokarzinom-Zellen in Hybrid-Hohlfaserbioreaktoren unter serumfreier Kultivierung XT in großer Menge, hoher Konzentration und hoher spezifischer Aktivität produzieren. Die XT konnte aus 18,5 Liter (entsprechen 2000 Liter normalem Überstand) angereichertem JAR-Zellkulturüberstand durch eine Kombination von Ammoniumsulfatfällung, Heparin-Affinitätschromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und Protamin-Affinitätschromatographie isoliert werden. Bei einer Gesamtausbeute von 1 v.H. wurde hierbei eine 4700fache Aufreinigung des Enzyms erreicht. Im SDS-Gel zeigte sich die gereinigte XT als eine Einzelbande bei 120 kDa. Unter nativen Bedingungen wurde ein Molekulargewicht der XT durch Gelfiltrations-Chromatographie von 500 kDa bzw. 120 kDa bestimmt. XT ist ein Glykoprotein, da sich das Molekulargewicht des Proteins durch N-Glykosidase F-Abbau um ca. 3 v.H. verringert. Das isolierte Protein wurde enzymatisch durch Trypsin und Endoproteinase Lys-C gespalten. Nach der Auftrennung des Peptidgemischs durch RP-HPLC wurden 11 Peptidfragmente durch Edman-Abbau sequenziert. Die erhaltenen Aminosäuresequenzen zeigten keinerlei Homologie zu bekannten Sequenzen in Protein- oder EST-Datenbanken. Auf der Grundlage dieser Sequenzen wurden Antikörper gegen das synthetische XT-homologe Peptid CSRQKELLKRKLEQQEK hergestellt. Nach Immobilisierung der gereinigten Antikörper konnte die XT in einer Immun-Affinitätschromatographie gebunden und durch das synthetische Antigen spezifisch eluiert werden. Mit diesen Antikörpern konnte zudem die XT durch Western-Blot-Analyse detektiert werden. Ein Antiserum gegen das synthetische XT-homologe Peptid CQFSEVGTDWDAKER führte zu einer etwa 50 prozentigen Inhibition der Enzymaktivität. Die immunologischen Untersuchungen beweisen, dass es sich bei dem isolierten Protein um das gesuchte Enzym, die Xylosyltransferase, handelt