Identification of Leptospira proteases involved in the degradation of extracellular matrix and plasma proteins

Leptospiras são bactérias espiroquetas altamente móveis dotadas de estratégias que possibilitam grande eficiência nos processos de invasão e disseminação no hospedeiro. Nosso grupo demonstrou previamente que leptospiras patogênicas secretam proteases capazes de clivar e inativar moléculas-chave do sistema complemento humano, o que confere a essas bactérias a capacidade de driblar os mecanismos de defesa do sistema imune inato. Dada a rápida disseminação das leptospiras durante o processo de infecção, aventou-se a hipótese de que essas proteases secretadas pudessem alvejar uma gama maior de moléculas do hospedeiro. No presente estudo, a atividade proteolítica de proteínas secretadas por leptospiras sobre um painel de moléculas da matriz extracelular e do plasma foi avaliada. O sobrenadante de cultura da estirpe virulenta L. interrogans sorovar Kennewicki Fromm degradou fibrinogênio humano, fibronectina plasmática, colágeno Tipo I, e as proteoglicanas decorina, biglicam e lumicam. A atividade proteolítica foi inibida por 1,10-fenantrolina, sugerindo o envolvimento de metaloproteases. Laminina, matrigel, plasminogênio e trombina não foram clivados por proteases presentes nos sobrenadantes. Ainda, os dados indicam que a produção de proteases deve ser um determinante de virulência importante, uma vez que os sobrenadantes de estirpes saprófitas ou patogênicas atenuadas em cultura não apresentaram atividade proteolítica sobre componentes da matriz ou do plasma. A análise dos genomas de leptospiras disponíveis nos levou à identificação de quatro termolisinas, metaloproteases presentes apenas nas espécies patogênicas. Uma delas, codificada pele LIC13322, foi produzida na forma recombinante e apresentou atividade proteolítica sobre fibrinogênio, biglicam e decorina. Em paralelo, foram também realizadas análises comparativas dos exoproteomas das estirpes Fromm e Patoc I. Algumas metaloproteases que podem estar envolvidas na degradação de moléculas do hospedeiro foram identificadas. A capacidade de clivar moléculas do tecido conjuntivo e proteínas da cascata de coagulação pode certamente contribuir para a invasão e a destruição tecidual observadas durante a infecção por Leptospira.Leptospires are highly motile spirochetes equipped with strategies for efficient invasion and dissemination within the host. Our group previously demonstrated that pathogenic leptospires secrete proteases capable of cleaving and inactivating key molecules of the human complement system, allowing these bacteria to circumvent host´s innate immune defense mechanisms. Given the successful dissemination of leptospires during infection, we wondered if such proteases would target a broader range of host molecules. In the present study, the proteolytic activity of secreted leptospiral proteases against a panel of extracellular matrix and plasma proteins was assessed. The culture supernatant of the virulent L. interrogans serovar Kennewicki strain Fromm degraded human fibrinogen, plasma fibronectin, collagen Type 1, and the proteoglycans decorin, biglycan, and lumican. Proteolytic activity was inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the participation of metalloproteases. Laminin, matrigel, plasminogen and thrombin were not cleaved by proteases present in the supernatants. Moreover, production of proteases might be an important virulence determinant since culture-attenuated or saprophytic Leptospira did not display proteolytic acticity against ECM or plasma components. A search against Leptospira genomes allowed identification of four thermolysins, which are metalloproteases found exclusively in pathogenic species. One of them, encoded by LIC13322, was produced in the recombinant form and displayed proteolytic activity against fibrinogen, biglycan and decorin. Comparative exoproteomic analyses using Fromm and Patoc I strains were also performed and allowed identification of a few metalloproteases that could be involved in the degradation of host components. The ability to cleave connective tissue molecules and coagulation cascade proteins may certainly contribute to invasion and tissue destruction observed upon infection with Leptospira