Antibacterial Amphiphilic Polymers Based On Enzymatically Synthesized Polycaprolactone

Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2017Thesis (Ph.D.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2017Polikaprolakton (PKL) bazlı amfifilik polimerler, enzimatik halka açılım polimerizasyonunun (eROP) fotopolimerizasyon veya atom transfer radikal polimerizasyon (ATRP) yöntemleri ile beraber kullanılarak sentezlenmiştir. ɛ-kaprolaktonun (KL) eROP yöntemi ile polimerizasyonu reaksiyonunda ester içeren nükleofilik başlatıcı kullanılarak oluşan yan reaksiyonlar incelenmiştir. Reaksion süresi, başlatıcı/lakton oranı ve reaksiyon sıcaklığı ile başlatıcı/lakton oranının sinerjik etkilerinin bu yan reaksiyonlara, dolayısıyla uç grup oluşumlarına etkileri incelenmiştir. Nükleofilik başlatıcı olarak 2-hidroksietil metakrilat (HEMA) ve biyokatalizör olarak Novozyme-435 (N435) immobilize lipaz enzimi kullanılmıştır. PKL bazlı amfifilik polimerlerin elde edilmesinde üç farklı yönteme başvurulmuştur. Birinci yöntemde yukarıda bahsedilen yan reaksiyonlardan faydalanılarak iki ucu da metakrilat içeren PKL bazlı makromonomer sentezlenmiştir. Reaksiyonun başlangıcında su nükleofilik başlatıcı olarak görev yapmıştır. Bununla birlikte etilen glikol dimetkrilat (EGDMA) da N435 tarafından parçalanmıştır. Reaksiyonun başlamasından bir süre sonra ortamdaki suyun vakumla uzaklaştırılması ile birlikte metakrilat fonksiyonel grupları PKL zincirlerinin uç gruplarına eklenmiştir. Elde edilen PKL’ nin, HEMA ve metakrilat uç gruplarının yanı sıra farklı hidroksil uç gruplarını da çeşitli kombinasyonlar oluşturacak şekilde içerdiği görülmüştür. Dolayısıyla, bu PKL karışımı dimetakrilatlı polikaprolakton (DMPKL) olarak adlandırılmıştır. Bir sonraki aşamada, poli(etilen glikol) metil eter metakrilat-950’ nin (PEGMA-950) fotopolimerizasyon reaksiyonunda, DMPKL ve trimetilpropan triakrilat (TMPTA) beraber çapraz bağlayıcı olarak ve ışık yayan diyot-ultraviyolet (LED-UV) kullanılmıştır. Amfifilik ağsı yapıların oluşturulduğu bu yöntemde Irgacure-819’ a fotobaşlatıcı olarak başvurulmuştur. PKL bazlı amfifilik yapıların elde edilmesi için diğer bir yöntem, hidroksil fonksiyonel gruplu Irgacure-2959 fotobaşlatıcısı, CL’ nun enzimatik polimerizasyonunda nükleofilik başlatıcı olarak kullanılmıştır. Böylece bir ucu fotobaşlatıcı, diğer ucu ise hidroksil fonksiyonlu PKL bazlı makrofotobaşlatıcı elde edilmiştir. Elde edilen makrofotobaşlatıcı, bütil akrilat (BuA), benzil akrilat (BzA), tetrahidrofürfüril akrilat (THFA), 2,2,2-trifloroetil akrilat (TFEA), 2-hidroksietil akrilat (HEA) ve poli(etilen glikol) metil eter akrilat-480 (PEGMEA-480) monomerlerinin UV polimerizasyonunda kullanılmıştır. Üçüncü yöntem olarak da, ATRP yöntemi ile önce PKL ve PEGMEA-480 içeren diblok kopolimeri, daha sonradan bu diblok kopolimer kullanılarak sülfobetain metakrilat (SBMA) tekrarlanan ünitelerini içeren triblok kopolimeri sentezlenmiştir. Bunun için önceden eROP yöntemi ile sentezlenen PKL, 2-bromoizobütiril bromit ile fonksiyonlandırılarak makrobaşlatıcıya dönüştürülmüştür. Yukarıda bahsedilen polimerik yapılar 1H nükleer magnetik rezonans (NMR), fourier transform kızılötesi spektroskopi-azaltılmış toplam yansıma (FTIR-ATR), diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC), boyut dışlama kromatografisi (SEC) yöntemleri ile karakterize edilmiştir. Antibakteriyel özellikler ise zon inhibisyonu testi ile analiz edilmiştir. Enzimatik halka açılım polimerizasyonu yöntemi ile metakrilat bazlı başlatıcı kullanılarak gerçekleştirilen PKL makromonomeri sentezi reaksiyonunda ana ve yan reaksiyonlar incelendiğinde, N435 lipaz katalizörünün, hem enzim-monomer kompleksini oluşturduğu hem de hidroksil fonksiyonel gruplu ester grubu içeren metakrilat başlatıcıdaki (HEMA) ester bağlarını parçalayarak yan reaksiyonlara sebep olacak ürün oluşturduğu görülmüştür. Bu çalışmalar ışığında, daha düşük monomer dönüşümü göz önüne alınarak reaksiyon sürelerinin de kısaltılması, yan reaksiyonların azaltılmasında bir başka yöntem olabilir. N435 enziminin ester içeren başlatıcılara karşı yüksek aktivitesinden faydalanılarak iki ucu da metakrilat içeren PKL makromonomeri sentezlenmiştir. Bu sentez yönteminin ilk bölümde gerçekleştirilen enzimatik sentezlerden farkı; ilk aşamada polimerizasyonun, monomer, enzim ve reaktörün içerisinde bulunan eser miktardaki suyun başlatıcı olarak kullanılması, daha sonra reaktöre yüksek vakum uygulayarak bu suyun ortamdan uzaklaştırılması ve enzimin ortamda bulunan metakrilat bazlı monomerik çapraz bağlayıcıyı (EGDMA) parçalayarak PKL’ nin iki ucuna eklemesidir. Bu şekilde sentezlenen dimetakrilatlı, çapraz bağlayıcı özellikli DMPKL, ultraviyolet polimerizasyonuna tabi tutularak PEGMA-950 ile amfifilik kopolimerleri sentezlenmiştir. Sabit triakrilat çapraz bağlayıcı konsantrasyonunda; PEGMA-950 ve DMPKL makromonomerlerinin konsantrasyonları (0.00, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00) değiştirildiğinde, her iki monomerin dönüşümü değerlendirildiğinde PEGMA-950 ve DMPKL birlikte kullanıldığı durumlarda, amfifilik kopolimerler elde edildiği gözlenmiştir. Aksi durumda, monomer dönüşümleri düşük çıkmaktadır. İkinci yaklaşım olarak amfifilik polimerlerin elde edilmesinde, enzimatik olarak PKL bazlı makrofotobaşlatıcı sentezi gerçekleştirilmiş ve fotopolimerizasyon yöntemi ile BuA, BzA, THFA, TFEA, HEA ve PEGMEA-480 monomerleri ile polimerizasyon reaksiyonları incelenmiştir. En yüksek polimerizasyon verimi benzil akrilat monomeri ile sağlanmıştır. Aynı zamanda, PEGMEA-480 ve HEA ile PKL bazlı amfifilik yapılar farklı bir yolla sentezlenebilmiştir. Sentezlenen amfifilik polimerlerin oda sıcaklığında jel formunda olması, DSC analizlerine göre düşük camsı geçiş noktası değerlerine sahip olması, kauçuğumsu yapıda oldukları, ana maddelerine göre amorf yapılarının arttığı ve bu nedenle biyomedikal uygulamalarda kullanılabilir olmasını sağlamaktadır. Son yaklaşım olarak, PEGMEA-480 ve SBMA içeren diblok ve triblok amfifilik kopolimerler sentezlenmiştir. ATRP yöntemi ile amfifilik diblok ve triblok kopolimerlerin daha kontrollü bir şekilde sentezlenmeleri hedeflenmiştir. Bunun için enzimatik olarak sentezlenmiş PKL önce 2-bromoizobutiril bromit ile ATRP makrobaşlatıcısına dönüştürülmüş ve PEGMEA-480 makromonomerinin ATRP reaksiyonu sonucu AB tipli P(KL)n-b¬-P(PEGMEA)m diblok kopolimeri elde edilmiştir. AB tipli kopolimer de yine makrobaşlatıcı olarak kullanılarak SBMA monomerinin ATRP reaksiyonu gerçekleştirilmiş ve ABC tipli P(KL)n-b¬-P(PEGMEA)m-b-P(SMBA)k triblok kopolimeri elde edilmiştir. PEGMEA-480 makromonomerinin polimerizasyon verimi 1H NMR yöntemi ile hesaplanabilmiştir, ancak triblok kopolimerinin çözünürlük probleminden dolayı 1H NMR’dan yalnızca kopolimerin varlığı ispatlanmış, ancak polimerizasyon verimi hesaplanamamıştır. Sentezlenmiş olan polimerik yapıların antibakteriyel özellikleri zon inhibisyon metodu ile incelenmiştir. PKL bazlı makrofotobaşlatıcı kullanılarak elde edilen PEGMEA-480 makromonomerinin fotopolimerizasyon ürünü Staphylococcus aureus (S. aureus) (Gram pozitif) ve Escherichia coli (E. coli) (Gram negatif) bakterilerine karşı antibakteriyel etki göstermiştir. Aynı şekilde enzimatik ve ATRP yöntemlerinin kombinasyonu ile elde edilen AB tipi P(KL)n-b¬-P(PEGMEA)m diblok kopolimeri de bu iki bakteriye karşı antibakteriyel özellik göstermiştir. Bunun yanında, yine AB tipli diblok kopolimeri kullanılan ABC tipi P(KL)n-b¬-P(PEGMEA)m-b-P(SMBA)k triblok kopolimerinin yalnızca S. aureus’a karşı antibakteriyel etkiye sahip olduğu gözlemlenmiştir. Bu polimerlerin Aspergillus niger (A. niger) mikroorganizmasına karşı antifungal etkisi gözlemlenememiştir. Elde edilen diğer polimerik yapılarda ise bahsi geçen mikroorganizmalara karşı antibakteriyel ve antifungal nitelik bulunamamıştır. PEGMEA-480 makromonomeri ve PKL içeren amfifilik yapıların antibakteriyel özellik göstermesi, PEGMEA-480 makromonomerinin yoğun bir şekilde tekrarlanan üniteler halinde polimerik yapıların içerisinde yer alabilmesinden kaynaklanmaktadır. Kullanılan polimerizasyon yöntemleri ve antibakteriyel testler, enzimatik halka açılım polimerizasyonunun ATRP veya ultraviyole polimerizasyonu yöntemleri ile kombinasyonları ile antibakteriyel polimerlerin sentezlenebildiğini göstermektedir. Bu, polimerlerin antibakteriyel özellik isteyen biyomedikal uygulamalarda (yara örtüsü, kateter) ve denizcilik uygulamalarında (boya hammaddesi) kullanılabilir olduğunu göstermektedir. İleride yapılacak yeni çalışmalarda bu bulgular yol gösterici olacaktır.Amphiphilic polycaprolactone (PCL) based polymers were synthesized utilizing three different approaches including the combination of enzymatic ring-opening polymerization (eROP) either with photopolymerization and atom transfer radical polymerization (ATRP). The side reactions during the synthesis of methacrylate initiated eROP of ɛ-caprolactone (CL) was scrutinized to reveal the formation of different end-groups. Effect of reaction time initiator/lactone ratio and the synergetic effect of temperature and initiator/lactone ratio as 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) was the nucleophilic initiator, Novozyme-435 (N435) was the immobilized lipase catalyst. α,ω-methacrylated PCL macromonomer was synthesized to have the benefit of the side reactions investigated at the first place, utilizing ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA). Since, water acted as the nucleophilic initiator in the beginning of the reaction, EGDMA was degraded by N435 and tailored onto the ends of the PCL chains resulting in mixture of macromonomers comprising a combination of methacrylate, HEMA, and hydroxyl end-groups together with ethylene glycol (EG) moieties along the chain. The mixture of PCL chains were concisely called as dimethacrylated PCL or α,ω-methacrylated PCL (DMPCL). DMPCL was employed as a long crosslinking agent in the photopolymerizaton of poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate-950 (PEGMA-950) with the aid of trimethylolpropane triacrylate (TMPTA) and Irgacure-819 as the initiator under light emitting diod (LED) ultraviolet (UV) bulbs. To achieve amphiphilic copolymer of PCL and poly(ethylene glycol) (PEG) with another strategy, a macrophotoinitiator based on PCL was again synthesized via eROP when Irgacure-2959 was used as the nucleophilic initiator. Light-induced polymerization was again applied to reach PCL copolymers with butyl acrylate (BuA), benzyl acrylate (BzA), tetrahydrofurfuryl acrylate (THFA), 2,2,2-trifluoroethyl acrylate (TFEA), 2-hydroxyethyl acrylate (HEA) and poly(ethylene glycol) methyl ether acrylate-480 (PEGMEA-480). PEGMEA-480 and sulfobetaine methacrylate (SBMA) were also installed on enzymatically synthesized PCL to achieve AB and ABC type block copolymers via ATRP. Following the end-functionalization of enzymatically synthesized PCL with 2-bromoisobutyryl bromide, diblock copolymer of P(CL)n-b-P(PEGMEA)m and triblock copolymer of P(CL)n-b¬-P(PEGMEA)m-b-P(SMBA)k were achieved. The structures of the abovementioned polymers were analysed with 1H nuclear magnetic resonance (NMR), fourier transform infrared spectroscopy-attenuated total reflection (FTIR-ATR), differential scanning calorimetry (DSC) and size exclusion chromatography (SEC). The antibacterial properties of the polymers were investigated via zone inhibition test method. The side reactions during the synthesis of methacrylate initiated enzymatic ring-opening polymerization of ɛ-caprolactone (CL) was scrutinized. It was revealed that N435 has high activity enough to catalyze enzyme-monomer complex formation, initiation, and propagation, cleaving the ester bond of the hydroxyl bearing acrylate initiator at the same time. Therefore, it was revealed that it might be preferable to study at lower reaction temperatures to reduce the side reactions inside the sufficient activity range of N435 or other lipase types. It is obvious to finalize the eROP at low reaction times and conversions in order to obtain lower side reactions and comparable HEMA addition. Furthermore, the lower enzyme amount might be preferable in order to realise higher HEMA addition, lower methacrylate transfer, comparable total methacrylate end-groups, and minimum EG inside the chains. HEMA/CL ratio can also be chosen minimum as both of the side reactions seemed to be lower at both temperatures and enzyme amounts, still conserving the total methacrylate amount sufficient. In addition to these, higher molecular weight and polymerization yield of macromonomers can be obtained at lower initiator/lactone ratios. To synthesize α,ω-methacrylated macromonomer for the application as a crosslinking agent in UV polymerization, it was benefited from the previously investigated side-reactions during eROP of CL when an ester containing initiator presented in the reactor. The double methacrylation of the PCL chains was evaluated to be a successful route, since the one-pot synthesis comprised of the primary synthesis of PCL enzymatically, and subsequent tailoring of the methacrylate groups onto the chains provided that all the water molecules were removed from the reaction mixture with high vacuum for high a conversion time. Furthermore, the conversion values without the usage of either PEGMA-950 or DMPCL didn’t give high conversion values of DMPCL and PEGMA-950. Therefore, the concurrent usage of DMPCL and PEGMA-950 in photopolymerization provided a synergetic influence for the conversion of both macromonomers with the help of TMPTA. The feed mole ratios 0.25, 0.50 and 0.75 for DMPCL (DMPCL/Total macromonomers) inside the photopolymerization mixture all gave high polymerization yields. Consequently, enzymatically polymerized dimethacrylated PCL macromonomer with average molecular weight of 4400 g/mole and 0.84 ratio of the total methacrylate end-groups was found to be an efficient crosslinking agent in photopolymerization and obtaining amphiphilic networks. It was noteworthy that the low Tg and Tm values of the amphiphilic networks revealed the rubbery and elastic behaviour of the materials. The enzymatic synthesis of PCL-based macrophotoinitiator was performed successfully. The macrophotoinitiator successfully photopolymerized the acrylate monomers: butyl acrylate, benzyl acrylate, tetrahydrofurfuryl acrylate, 2,2,2-trifluoroethyl acrylate, 2-hydroxyethyl acrylate and poly (ethylene glycol) methyl ether acrylate ~ 480 g/mole). Benzyl acrylate and tetrahydrofurfuryl acrylate had the highest conversion values. The block copolymer structure of poly(CL-b-BzA) and high conversion was confirmed with a single and broad Tg value with a high step decrease of the specific heat capacity. The relatively high dry polymer conversions for gel formation by using HEA and PEGMEA-480 monomers in photopolymerization also proved the efficiency of amphiphilic polymer synthesis via PCL based macrophotoinitiator. The low Tg value, thus the rubbery state, of the amphiphilic gels also made it possible for their usage in biomedical applications together with the biocompatible nature of the employed macromonomers. A chemoenzymatic route was utilized in order to synthesize amphiphilic diblock copolymer (P(CL)n-b¬-P(PEGMEA)m) and an amphiphilic triblock copolymer comprising zwitterionic monomer units (P(CL)n-b¬-P(PEGMEA)m-b-P(SMBA)k). It should be noted that the third polymer segment was installed by the synthesis of a methacrylate via ATRP onto an polyacrylate based diblock macroinitiator. Furthermore, the low solubility of the diblock copolymer in the reaction solvent ethanol/water mixture was also one of the challenging points of the third monomer addition. Another barrier for both PEGMEA-480 and SBMA ATRP polymerizations might be the steric hinderence of PEGMEA-480 brush segments together with the possible entaglements of the PEG chains. However, PEGMEA-480 conversion was calculated as 65% and SBMA was proven to be polymerized with diblock ATRP macroinitiator. Amphiphilic diblock copolymers comprised of PCL and PEG synthesized via photopolymerization and ATRP approaches both had antibacterial activity against S. aureus (Gram positive) and E. coli (Gram negative). The triblock copolymer, based on PCL, PEG and PSMBA was only antibacterial against S. aureus. However, neither of the polymers provided antifungal activity against A. niger. Antifouling feature assay might also be performed for the synthesized polymers, since composing antifouling surfaces is one of the candidate routes to obtain antibacterial activity due to their capability of inhibition of the protein based molecules which are employed by microorganisms to simplify their settlemt on surfaces. Protein adsorption test might be a method to investigate antifouling features. Consequently, enzymatic ring-opening polymerization in combination with photopolymerization or ATRP was found to be an approach to synthesize polymers performing antibacterial properties which might find applications in biomedical and marine uses.DoktoraPh.D