Régulation du facteur de transcription Lozenge et du développement des cellules sanguines par MLF et son partenaire DnaJ-1

Hematopoiesis is the process of formation of fully differentiated blood cells from hematopoietic stem cells (HSCs). This process is tightly controlled by the integration of developmental and homeostatic signals to ensure the generation of an appropriate number of each blood cell type. At the molecular level, the regulation of this developmental process is mediated by a number of transcription factors, especially by members of the RUNX family, and mutations affecting these factors are at the origin of numerous hemopathies, including leukemia. Intriguingly, many transcriptional regulators and signaling pathways controlling blood cell development are evolutionarily conserved from humans to Drosophila melanogaster. Hence, the fruit fly has become a potent and simplified model to study the mechanisms underlying the specification of blood cell lineages and the regulation of blood cell homeostasis. Members of the Myeloid Leukemia Factor (MLF) family have been implicated in hematopoiesis and in oncogenic blood cell transformation, but their function and molecular mechanism of action remain elusive. Previous work in Drosophila showed that MLF stabilizes the RUNX transcription factor Lozenge (LZ) and controls the number of LZ+ blood cells. During my PhD, I sought to further decipher the molecular mechanism of action of MLF on Lozenge during blood cell development. Using a proteomic approach in Drosophila Kc167 cells, we identified the Hsp40 co-chaperone family member DnaJ-1 and its chaperone partner Hsc70-4 as two partners of MLF. These interactions were confirmed by co-immunoprecipitations and in vitro pull-down assays. Importantly, we found that knocking down DnaJ-1 or Hsc70-4 expression in Kc167 cells caused a reduction in the level of Lozenge protein and a concomitant decrease in Lozenge transactivation activity, which were very similar to those caused by MLF knock-down. Similarly, over-expression of two DnaJ-1 mutants that are unable to stimulate the chaperone activity of Hsc70-4 also decreased Lozenge level and impaired its capacity to activate transcription. These results suggest that MLF could act within a chaperone complex composed of DnaJ-1 and Hsc70-4 to control Lozenge stability and activity. Along that line, we showed by co-immunoprecipitation that Lozenge interacts with MLF, DnaJ-1 and Hsc70-4, respectively. Using various truncated mutants of MLF or DnaJ-1, we showed that MLF and DnaJ-1 interact and together with Lozenge through their conserved MLF homology domain (MHD) and C-terminal region, respectively. Furthermore, in vitro GST pull-down assays suggested that the interactions between MLF, DnaJ-1 and Lozenge are direct. Thus, we propose that MLF and DnaJ-1 control Lozenge protein level by interacting with it and by promoting its folding and/or solubility via the Hsc70 chaperone machinery. In parallel, we assessed DnaJ-1 function in Drosophila blood cells in vivo using a null allele of dnaj-1 generated by CRISPR/Cas9 technique. We found that, like mlf, dnaj-1 mutation leads to an increase in the number and size of LZ+ blood cells, as well as to an over-activation of the Notch signaling pathway in these cells. Moreover, our data suggested that high levels of active Lozenge are required to control the number and size of LZ+ blood cells, and to down-regulate Notch expression. We propose that the MLF/DnaJ-1 complex controls LZ+ blood cell development in vivo by regulating Lozenge protein level/activity and thereby Notch pathway activation. In sum, our results establish a functional link between MLF, the Hsp40 co-chaperone DnaJ-1 and the RUNX transcription factor Lozenge, which could be conserved in other species.L'hématopoïèse est le processus de formation des cellules sanguines différenciées à partir de cellules souches hématopoïétiques. Ce processus est étroitement contrôlé par l'intégration de signaux de développementaux et homéostatiques pour assurer une production équilibrée des différents types de cellules sanguines. Au niveau moléculaire, la régulation de ce processus est médiée par un certain nombre de facteurs de transcription, en particulier par les membres de la famille RUNX. Ainsi, des mutations affectant les membres de cette famille peuvent entrainer une déréglementation du programme de différenciation hématopoïétique et causer des hémopathies, dont des leucémies. D'une manière intrigante, de nombreux régulateurs de la transcription et des voies de signalisation contrôlant le développement des cellules sanguines sont évolutivement conservés des humains à Drosophila melanogaster, qui est donc utilisée comme organisme modèle pour étudier les mécanismes sous-jacents à la spécification des lignages sanguins et au contrôle de l'homéostasie des cellules sanguines. Les membres de la famille Myeloid Leukemia Factor (MLF) ont été impliqués dans l'hématopoïèse et dans la transformation oncogénique des cellules sanguines, mais leur fonction et leur mécanisme d'action moléculaire restent insaisissables. Des travaux précédents chez la Drosophile ont montré que MLF stabilise le facteur de transcription de type RUNX Lozenge (LZ) et contrôle le nombre de cellules sanguines LZ+. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à déchiffrer le mécanisme moléculaire d'action de MLF sur Lozenge dans les cellules sanguines. Par une approche protéomique puis par des expériences de co-immunoprécipitation dans les cellules de Drosophile Kc167, nous avons identifié le co-chaperon de type Hsp40 DnaJ-1, et son partenaire le chaperon Hsc70-4, comme deux partenaires de MLF. De façon importante, nous avons montré que l'inhibition de l'expression de DnaJ-1 ou de Hsc70-4 dans les cellules Kc167 induit une réduction du niveau de protéine Lozenge et une diminution de sa capacité à activer la transcription très semblable à celles observées suite à l'inhibition de l'expression de MLF. De plus, la sur-expression de mutants de DnaJ-1 incapables d'activer le chaperon Hsc70-4 entraîne aussi une réduction du niveau de Lozenge et de sa capacité de transactivation et des expériences de coimmunoprécipitation montrent que Lozenge interagit avec MLF, DnaJ-1 et Hsc70-4. Nos résultats suggèrent donc que MLF agit au sein d'un complexe chaperon composé de DnaJ-1 et Hsc70-4 pour contrôler le niveau de Lozenge. En utilisant différents mutants de MLF ou DnaJ-1, nous avons montré que MLF et DnaJ-1 interagissent ensemble et avec Lozenge via des domaines phylogénétiquement conservés. D'autre part, des expériences de GST " pull down " in vitro suggèrent que ces trois protéines peuvent interagir ensemble directement. Nous proposons donc que MLF et DnaJ-1 contrôlent le niveau de protéine Lozenge en interagissant avec elle et en favorisant son repliement et/ou sa solubilité via l'activité chaperon de Hsc70-4. En parallèle, nous avons étudié la fonction de DnaJ-1 in vivo dans le développement des cellules sanguines de la Drosophile. Nos résultats montrent que, comme mlf, la perte de dnaj-1 s'accompagne d'une augmentation de la taille et du nombre des cellules sanguines LZ+, ainsi que d'une hyperactivation de la voie de signalisation Notch dans ces cellules. Nos résultats suggèrent que des hauts niveaux de Lozenge sont nécessaires pour contrôler le nombre et la taille des cellules LZ+ et pour inhiber l'expression de Notch. Nous proposons que le complexe MLF/DnaJ-1 contrôle le développement du lignage LZ+ en régulant le niveau de protéine Lozenge, et ainsi le niveau d'activité de la voie Notch. En conclusion, nos résultats ont mis à jour un lien fonctionnel entre MLF, le co-chaperon de type Hsp40 DnaJ-1 et un facteur de transcription de type RUNX, qui pourrait être conservé dans d'autres espèces