Papel del motivo LExE de las DNA polimerasas que inician con proteína terminal en la interacción con el nucleótido entrante. Estabilización de los sustratos en el centro activo de polimerización mediada por el subdominio TPR1

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 22-09-2017Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 22-03-2019El motivo LExE se encuentra conservado en todas las DNA polimerasas del tipo eucariota, y se localiza cerca del centro activo de polimerización. Estudios previos sugieren que el segundo Glu interacciona con el tercer ion no catalítico en la DNA polimerasa de RB69. En el subgrupo de las DNA polimerasas que inician la replicación con proteína terminal (TP), el primer Glu del motivo LExE está sustituido por Phe/Trp y precedido por una Gly. Se construyeron mutantes puntuales para los residuos aminoacídicos Gly481, Trp483, Ala484 y Glu486 pertenecientes a la DNA polimerasa de ϕ29. Los resultados obtenidos junto a la resolución cristalográfica de la estructura del complejo ternario de la DNA polimerasa de ϕ29 nos permiten concluir que la Gly481 y el Trp483 podrían estar formando un bolsillo donde se acomoda la cadena lateral de la Val250, orientándola correctamente para interaccionar con el dNTP entrante. Los mutantes en el residuo Glu486 son también deficientes en polimerización y, como los mutantes en los residuos Gly481 y Trp483, en la actividad de pirofosforolisis cuando se usa el ion Mg2+, recuperando ambas actividades en presencia de Mn2+ e indicando un posible papel del Glu486 en la interacción con la fracción de pirofosfato del dNTP. La DNA polimerasa del fago ϕ29 contiene dos subdominios denominados TPR1 y TPR2 (Terminal Protein Region), específicos de las DNA polimerasas del subgrupo de Proteinpriming. Estudios previos llevados a cabo sobre la región TPR1 de la DNA polimerasa de ϕ29 revelaron que este subdominio establece las principales interacciones con la TP, además de contribuir a la correcta orientación tanto del extremo 3´-OH de una cadena iniciadora de DNA como del grupo OH- de la Ser232 de la TP en el centro activo de polimerización (Dufour et al., 2000; Dufour et al., 2003). El estudio de los residuos del subdominio TPR1 localizados en el loop y situados en la entrada del surco de unión de los sustratos de la polimerasa, DNA y TP, permiten concluir un papel en la unión y/o estabilización de la molécula iniciadora en el centro activo de polimerización para el residuo Tyr310. Además, el residuo Tyr310 es importante para la correcta estabilización de la TP iniciadora en el centro activo de polimerización de la DNA polimerasa durante los procesos de síntesis de DNA. Así mismo, los mutantes puntuales R306A y F309A presentan deficiencias en las reacciones de iniciación de la replicación y posterior elongación cuando se utiliza como iniciador la proteína terminal, a pesar de cosedimentar con esta última. Estos resultados indican que las DNA polimerasas mutantes no son capaces de situar de manera correcta el dATP iniciador en el centro activo de polimerización, sugiriendo que los residuos Arg306 y Phe309 contribuyen a la correcta orientación del grupo OH- de la Ser232 en la iniciación de la replicación del genoma del fago.The LExE motif is conserved in the eukaryotic-type DNA polymerases being located close to the polymerization active site. Previous researches suggested that the second Glu was involved in binding a third noncatalytic ion in bacteriophage RB69 DNA polymerase. In the Protein-priming DNA polymerases subgroup, the LEXE motif lacks the first Glu in most cases, but it has a conserved Phe/Trp and a Gly preceding it. To ascertain the role of those residues, we have analyzed the behavior of mutants at the corresponding ϕ29 DNA polymerase residues Gly481, Trp483, Ala484, and Glu486. We show that mutations at Gly481 and Trp483 hamper insertion of the incoming dNTP in the presence of Mg2+ ions, a reaction highly improved when Mn2+ was used as metal activator. These results, together with previous crystallographic resolution of ϕ29 DNA polymerase ternary complex, allow us to infer that Gly481 and Trp483 could form a pocket that orients Val250 to interact with the incoming dNTP. Mutants at Glu486 are also defective in polymerization and, as mutants at Gly481 and Trp483, in the pyrophosphorolytic activity with Mg2+. Recovery of both reactions with Mn2+ supports a role for Glu486 in the interaction with the pyrophosphate moiety of the dNTP. ϕ29 DNA polymerase contains two subdomains, named TPR1 and TPR2 (Terminal Protein Region), specifically present in the protein-priming DNA polymerases subgroup. Previous studies revealed an important role of the TPR1 subdomain in establishing the main interactions with TP. It also contributes to the right orientation of both, the terminal 3’-OH group of the primer DNA strand and the OH- group of the TP residue Ser232 at the polymerization active site (Dufour et al., 2000; Dufour et al., 2003). In the second part of this work we have focused on specific residues of the TPR1 subdomain loop which are localized at the entrance of the DNA and TP binding groove. Our results allow us to conclude a role for Tyr310 in the correct stabilization/orientation of the priming molecule at the polymerization active site during the DNA synthesis process. Likewise, we have shown that R306A y F309A mutants exhibit defects during initiation of replication and further elongation when using a TP as primer, despite of cosedimenting with the latter protein. Altogether, the results indicate that the mutant DNA polymerases are unable to place correctly the initiator dATP molecule at the polymerization active site, suggesting that residues Arg306 y Phe309 contribute to the correct orientation of the OH- group of TP Ser232 during the initiation of phage genome replication