Prostate tumor heterogeneity and aggressiveness revealed via the androgen receptor expression and activation by tyrosine phosphorylation

Purpose: Prostate cancer (PCa) is among leading causes of cancer deaths in North America. To date, androgen-deprivation therapy (ADT) is the gold standard treatment for patients with biochemical recurrence (BCR) after radical prostatectomy or radiation therapy. However, ADT invariably fails and is followed by castration resistance (CRPC) and further progression of the disease. The host lab study on signaling through the Fer tyrosine kinase in PCa has led to the identification of the androgen receptor (AR) as a Fer substrate, activated by phosphorylation on the tyrosine (Y) 223 residue, a step followed by the accumulation of Fer and activated AR complexes in the nucleus. Moreover, the analysis of these proteins revealed that Fer and AR are at high levels in the tumor cell nucleus of advanced CRPC patients. The hypothesis is that activated pY223AR reflects tumor cell aggressiveness and may serve as a biomarker of advanced PCa. The aim was to quantify pY223AR, along with AR proteins, in hope to distinguish full length AR and all forms, including small variants lacking the C-terminal ligand binding domain.Methods: IHC was performed using AR C- and N- terminal Abs and specifically raised pY223AR Abs on sections from human prostates covering the whole spectrum of proliferative diseases and metastases from PCa. AR and pY223AR levels (0-3+) and cytoplasmic vs. nuclear distribution were quantified and expressed in percentages (%) and by H scores. Results were statistically analyzed to determine significant differences between groups and predictive value of the studied markers. Results: The number of AR negative cells increased with progression, up to 16% in ADT/CRPC cases. In positive cells, AR was primarily nuclear. In cells of primary tumors stained with C-terminal Abs, the nuclear intensity remained at +1; H scores increased with Gleason score (GS) (p<0.01), being most elevated in ADT/CRPC patients, primary tumors and matched LNs, seminal vesicles extension and bone metastases. Quantification with N- terminal Abs revealed similar observations up to GS8, where a shift in higher intensity (+3 and +2 vs. +1) was observed and persisted in all tissue samples categorized as advanced. Nuclear AR levels did not correlate with BCR. Quantification of pY223AR showed that prostate epithelial cells of both normal and BPH cases expressing AR but not Fer were negative for pY223AR. In tumors, the nuclear pY223AR intensity of positive cells and H scores increased with GS of primary tumors (p<0.01), being most elevated in ADT/CRPC patients. Results were similarly elevated for primary tumors and their matched LNs, seminal vesicles extension and bone metastases. Statistical analyses (KM, COX regression and ROC) showed that nuclear pY223AR H scores significantly correlate with BCR and improve prognostication of standard parameters. In addition, the AR expression pattern in fibroblasts confirmed findings in literature, with its presence observed from the normal prostate up to cancer of GS7, and loss in GS8 and all subsequent prostate tissues of more aggressive cases or advanced stages. The loss of AR in fibroblasts was predictive of BCR. Of interest, AR was activated (pY223) in prostatic fibroblasts, but only in cancer cases of GS6 and GS7. Moreover, the extent of inflammation had a predictive value for BCR and its combination with pY223AR H scores in cancer cells further enhanced prognostic value.Conclusions: Prostate tumor foci and metastases are heterogeneous with regards to cancer cells expressing AR. AR proteins detected through a N-terminal epitope showed significant relationships with disease progression, which was not observed with C-terminal Abs. AR in PCa cells did not correlate with patient outcome, whereas AR activation by Y223 phosphorylation in tumor cells had high predictive value, which was enhanced by inflammation. Préambule : Le cancer de la prostate (PC) est parmi les principales causes de décès par cancer en Amérique du Nord. À ce jour, la privation d'androgènes (ADT) est la norme de traitement pour les patients affectés de récidive biochimique (BCR) après prostatectomie radicale ou radiothérapie. Cependant, l'ADT échoue invariablement et est suivie d'une résistance à la castration (CRPC) et de la progression du PC. L'étude du laboratoire sur la signalisation par la tyrosine kinase Fer dans le PC a permis d'identifier le récepteur des androgènes (AR) comme substrat de Fer, activé par phosphorylation sur tyrosine (Y) 223, une étape suivie de l'accumulation de complexes de Fer et AR activé dans le noyau. En outre, l'analyse de ces protéines chez l'humain a révélé que les niveaux de Fer et AR sont élevés dans le noyau des cellules tumorales de patients CRPC. L'hypothèse est que le AR activé -pY223AR, reflète l'agressivité tumorale et peut devenir un marqueur du PC avancé. L'objectif était de quantifier pY223AR ainsi que le AR afin de distinguer ses formes pleine longueur et courts variants dépourvus du domaine de liaison du ligand en C-terminal.Méthodes : L'IHC a été réalisée à l'aide d'anticorps (Abs) du AR, C- et N- terminal, et d'Abs spécifiques du pY223AR sur des sections de prostate couvrant tout le spectre de ses maladies prolifératives et de métastases du PC. AR et pY223AR ont été quantifiés dans le cytoplasme et les noyaux selon leurs niveaux (0 à 3+) et exprimés en pourcentage ( %) et par H scores. Les tests statistiques réalisés visaient à déterminer si les différences entre les groupes sont significatives et si les marqueurs étudiés ont une valeur prédictive.Résultats : Le nombre de cellules négatives augmente avec la progression, et jusqu'à 16% pour les cas d'ADT/CRPC. Dans les cellules positives, AR est principalement nucléaire. L'intensité nucléaire du AR détecté avec l'Abs C-terminal demeure à 1+; les H scores augmentent avec les scores de Gleason (GS) (p <0,01), étant plus élevés dans les tumeurs primaires des cas ADT/CRPC, celles couplées à leurs LNs, l'extension tumorale aux vésicules séminales et les métastases osseuses. La quantification avec l'Abs N-terminal a révélé des observations similaires jusqu'au GS8, où une augmentation d'intensité vers 3+ et 2+ a été observée et a persisté dans tous cas de PC agressif et avancé. Le AR nucléaire ne corrèle pas avec la BCR. La quantification de pY223AR a montré son absence dans les cellules épithéliales de la prostate normales et HBP exprimant AR mais pas Fer. Dans les tumeurs, l'intensité nucléaire du pY223AR et les H scores augmentent avec le GS (p <0,01), étant plus élevée dans l'ADT/CRPC, les tumeurs primaires avec leurs LNs, les extensions aux vésicules séminales et les métastases osseuses. Les analyses statistiques (KM, régression de Cox et ROC) ont montré que les H scores du pY223AR H corrèlent avec la BCR et améliorent la valeur pronostique des paramètres standard. De plus, l'expression du AR dans les fibroblastes confirme les données de la littérature, soit son expression jusqu'à GS7, puis perdue au GS8 et absent des cas plus agressifs et avancés. Cette perte du AR prédit la BCR. D'intérêt, le AR est activé (pY223) dans les fibroblastes mais uniquement dans les cas de GS6 et GS7. De plus, l'étendue de l'inflammation a une valeur prédictive de la BCR et son association avec les H scores du pY223AR dans les cellules cancéreuses augmente sa valeur pronostique.Conclusion : Les cellules des tumeurs et métastases prostatiques sont hétérogènes quant à l'expression du AR. Les protéines détectées par l'épitope N-terminal sont étroitement associées avec la progression, ce qui n'est pas le cas pour le AR détecté par l'épitope C-terminal. Le AR des cellules du PC de ne corrèle pas avec l'évolution clinique mais sa forme activée -pY223AR a une valeur prédictive élevée, augmentée par l'inflammation