Enzymatic modifications of osteopontin and their role in mineralization

Biomineralization in skeletal tissues is a cell- and protein-mediated process involving the production of an appropriate extracellular matrix (predominantly fibrillar type 1 collagen) that is hardened (mineralized) by hydroxyapatite crystals. This process is controlled by molecular determinants that regulate crystal deposition and crystal growth. One of these regulatory molecules is osteopontin (OPN) – a secreted, extracellular matrix constituent of bone, with characterized functions in regulating mineralization and cell attachment. OPN is a phosphorylated (abundant P-Ser) glycoprotein having a high content of acidic amino acids (Asp and Glu) and an intrinsically disordered structure that allows it to bind to the cations on the surface of mineral crystals such as hydroxyapatite. Furthermore, it has centrally located integrin-binding motifs that are known to elicit cell attachment, cell migration and chemotaxis in multiple tissues. The precise roles that OPN performs in bone are determined not only by its expression pattern, but also by its post-translational modifications, thus allowing it to be a multifunctional protein. The aim of this dissertation was to identify and characterize novel post-translational modifications and their influence on OPN function in bone. In this study, PHEX was identified as a novel proteolytic enzyme that extensively degrades OPN, thus inactivating its mineralization-inhibiting function. This was supported by in vivo findings showing that in the absence of PHEX activity, OPN and OPN fragments accumulated in bone tissue, thus contributing to a locally controlled mineralization-inhibiting effect independent of circulating factors. The polymerization of OPN by tissue transglutaminase 2 was also shown to attenuate the mineralization-inhibitory properties of monomeric OPN by affecting its secondary structure and size. Lastly, OPN was identified to be a novel substrate for proprotein convertase 5/6 (PC5/6) in bone, and cleavage by PC5/6 was proposed to affect the cell attachment properties of OPN by exposing its integrin-binding sites. These findings further the understanding of the role of OPN in the finely tuned regulation of mineralization processes in bone.La biominéralisation des tissus squelettiques résulte d'interactions cellulaires, protéiques à l'origine de la synthèse d'une matrice extracellulaire appropriée (essentiellement de collagène de type I). Cette matrice va ensuite se minéraliser par l'apposition de cristaux d'hydroxyapatite. Ce processus est contrôlé par les déterminants moléculaires qui régulent la déposition et la croissance cristalline. Une de ces molécules régulatrices est l'ostéopontine (OPN) – un constituant sécrété de la matrice extracellulaire osseuse, avec des fonctions spécifiques pour contrôler la minéralisation et l'adhésion cellulaire. OPN est une glycoprotéine phosphorylée (sites abondants de phosphosérine) avec une teneur élevée en acides aspartique et glutamique et une structure intrinsèquement désordonnée qui lui permet de se lier aux cations situés à la surface des cristaux, tel que l'hydroxyapatite. De plus, elle possède des motifs liant les intégrines qui permettent l'adhésion, la migration et la chimiotaxie des cellules dans plusieurs tissus. La multifonctionnalité de l'OPN dans l'os est permise non seulement par son profil d'expression mais aussi par les modifications post-traductionnelles qu'elle a subi. L'objectif de cette thèse était d'identifier et de caractériser des nouvelles modifications post-traductionnelles de l'OPN et leurs conséquences sur la fonction de l'OPN dans l'os. Dans cette étude, PHEX a été identifiée comme une nouvelle enzyme protéolytique qui dégrade considérablement l'OPN, donc désactivant sa fonction inhibitrice de la minéralisation. Ces résultats sont soutenus par des études in vivo qui montrent qu'en l'absence d'activité de PHEX, l'OPN et ses fragments s'accumulent dans le tissu osseux. Ceci contribuerait ainsi à une inhibition locale de la minéralisation qui serait indépendante des facteurs circulants. La polymérisation d'OPN par la transglutaminase 2 a aussi été démontrée comme atténuant les propriétés inhibitrices de minéralisation de l'OPN monomérique par la modification de sa structure secondaire et de sa taille. Enfin, l'OPN a été identifiée comme un nouveau substrat pour la proprotéine convertase de type 5/6 (PC 5/6) dans l'os. Le clivage de l'OPN par PC 5/6 affecterait les propriétés d'adhésion cellulaire de l'OPN en exposant ses sites de liaison Intégrine. Ces résultats permettent de mieux comprendre le rôle de l'OPN dans la régulation fine du processus de minéralisation osseuse