Neue Formulierungen zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit von schlecht wasserlöslichen und schlecht permeablen Arzneistoffen

Since four decades, high-throughput screenings have been conducted in drug discovery, fuelling the identification of potential new drug candidates. This approach, however, often promotes the detection of compounds with undesired physico-chemical properties like poor aqueous solubility or low membrane permeability. Indeed, dissolution and absorption of a drug are prerequisites for systemic exposure and therapeutic effects. Therefore, innovative strategies to optimize unfavourable performance of new drug candidates are in great demand in order to increase drug concentrations at the site of action whilst simultaneously reducing drug variability. In chapter I of this research work, hydrophobic ion pairing (HIP) is discussed as a promising strategy to improve the bioavailability of BCS class III compounds, which have high aqueous solubility and low permeability. The review points out the limitations of poorly absorbable drugs and details the approach of pairing these APIs with hydrophobic counterions. Apart from the motivation to tailor physico-chemical, biopharmaceutical and toxicological properties of BCS class III compounds, the hydrophobic ion pairing facilitates their formulation into drug delivery systems. Besides advantageous effects, disadvantages of the ion pair formation, such as the decreased aqueous solubility of the ions pair, are critically outlined. Finally, the review covers an overview of non-invasive administration routes permitted after ion pair formation, including oral/enteral, buccal, nasal, ocular and transdermal drug administration. Overall, the HIP approach offers substantial benefits regarding the bioavailability enhancement of BCS class III compounds. Chapter II concerns GHQ168 developed by Holzgrabe et al., a BCS class II compound characterized by low aqueous solubility and high permeability. GHQ168 was developed for the treatment of human African trypanosomiasis (HAT), a tropical disease for which novel active compounds are urgently needed. This lead compound was found to be very active against trypanosoma brucei brucei and trypanosoma brucei rhodesiense in cell culture assays, however, the low aqueous solubility prevented further preclinical development. To target this drawback, two different approaches were selected, including (I) the chemical modification and (II) the spray drying of GHQ168. The newly synthesized set of derivatives as well as the spray dried GHQ168 were subjected to a physico-chemical and microbiological characterization. It turned out that both approaches successfully improved aqueous solubility, however, for the derivatives of GHQ168 at the expense of activity. Furthermore, the pharmacokinetic parameters of GHQ168 and of the most active derivatives, GHQ242 and GHQ243, were evaluated. Elimination half-lives between 1.5 to 3.5 h after intraperitoneal administration and modest to strong serum albumin binding for GHQ243 (45%) and GHQ168 (80%) and very high binding (> 99%) for GHQ242 were detected. The spray dried formulation of GHQ168, as well as GHQ242 and GHQ243 were investigated in two in vivo studies in mice infected with t. b. rhodesiense (STIB900), referred to as (I) stringent model and (II) early-treatment model. In the stringent model (2 applications/day on day 3-6 after infection) the mean survival duration (MSD) of mice treated with spray dried GHQ168 exceeded the MSD of the untreated control group (17 days versus 9 days), a difference that was statistically significant. In contrast, no statistical difference was observed for GHQ242 (14 days) and GHQ243 (12 days). GHQ168 was further assessed in the early-treatment model (2 applications/day on day 1-4 after infection) and again a statistically significant improvement of MSD (32 days (end of observation period) versus 7 days) was observed. Finally, exciting antitrypanosomal efficacy for the spray dried formulation of GHQ168 was demonstrated. NADPH oxidases (NOX) were found to be the main source of endothelial reactive oxygen species (ROS) formation. Chapter III reports on the formulation studies on triazolopyrimidine derivatives from the VAS library, a set of NADPH oxidase inhibitors. These were developed for the treatment of elevated ROS levels, which contribute to the development of cardiovascular diseases. Although in vitro results from numerous studies indicated promising efficacy and selectivity for the VAS-compounds, the low water solubility impeded the in vivo translation and further preclinical development. For this reason, three derivatives, VAS2870, VAS3947, and VAS4024 were physico-chemically characterized and VAS3947, the most soluble compound, was selected for further formulation studies. These approaches included (I) spray drying, (II) microemulsification and (III) complexation with cyclodextrins in order to develop formulations for oral and parenteral application. Solubility improvement of VAS3947 was successfully demonstrated for all preparations as expressed by supersaturation ratios in comparison to the solubility of the unformulated compound. For seven spray dried formulations, the ratio ranged from 3-9, and the ratio for four microemulsions was 8-19 after 120 min, respectively. The six cyclodextrin formulations achieved the highest supersaturation ratio between 3 and 174 after 20 hours. NMR measurements elucidated the inclusion of VAS3947 within the CD’s cavity as well as the interaction with its outer surface. Ultimately, NOX inhibitors were opened for oral and parenteral administration for the first time. After successful solubility improvement of VAS3947, further investigations towards in vivo studies were conducted including stability studies with a focus on stability in solution and in plasma as presented in chapter IV. Furthermore, permeability and cytotoxicity assays were performed for the first time. It turned out that VAS3947 was instable in buffer and when exposed to light. Moreover, the compound showed decomposition in the presence of mouse microsomes and in human plasma. The VAS compounds contain an oxazol moiety linked to the triazolopyrimidine skeleton via a thioether. This structural element is responsible for the efficacy of the compound class, however it is susceptible to hydrolysis and to further degradation reactions. Moreover, VAS3947 harmed membrane integrity in the cell permeability assays and cytotoxicity investigations in HEK-293 and HEP-G2 cells revealed IC50 values in the same concentration range as reported for efficacy assays. Summarized, it was demonstrated that substances from the VAS library were no appropriate model compounds for ROS investigations nor suitable candidates for further preclinical development.Seit vier Jahrzehnten werden Hochdurchsatz-Screenings in der Arzneimittelforschung durchgeführt, was die Erkennung von potentiellen Wirkstoffkandidaten vorantreibt. Diese Vorgehensweise begünstigt jedoch häufig die Identifizierung von Substanzen mit unerwünschten physikochemischen Eigenschaften wie geringer Wasserlöslichkeit oder geringer Membranpermeabilität. Der Bioverfügbarkeitstheorie zufolge sind die Auflösung und die Absorption eines Arzneistoffs Voraussetzung für die systemische Verfügbarkeit und die therapeutische Wirkung. Daher werden innovative Strategien, die die ungünstigen Eigenschaften neuer Wirkstoffkandidaten optimieren, dringend benötigt, um die Arzneistoffkonzentration am Wirkort zu erhöhen und gleichzeitig Wirkstoffschwankungen zu reduzieren. In Kapitel I dieser Forschungsarbeit wird die hydrophobe Ionenpaarbildung als vielversprechende Strategie diskutiert, um die Bioverfügbarkeit von BCS Klasse III Substanzen zu verbessern, die sich durch hohe Wasserlöslichkeit und geringe Permeabilität auszeichnen. Der Review zeigt die Grenzen von schlecht absorbierbaren Arzneistoffen auf und stellt den Ansatz vor, diese mit hydrophoben Gegenionen zu kombinieren. Abgesehen von der Motivation, die physikochemischen, biopharma-zeutischen und toxikologischen Eigenschaften von BCS Klasse III Substanzen positiv zu beeinflussen, wird die Formulierung der hydrophoben Ionenpaare in Trägersysteme erleichtert. Neben den Vorteilen werden auch die Nachteile der hydrophoben Ionenpaarbildung, wie beispielsweise die geringere Wasserlöslichkeit der Ionenpaare, kritisch dargestellt. Abschließend gibt der Review eine Übersicht über die verschiedenen nicht-invasiven Applikationsrouten, die nach hydrophober Ionenpaarbildung realisierbar sind, was die orale/enterale, bukkale, nasale, okulare und transdermale Arzneistoffgabe umfasst. Insgesamt bietet dieser Formulierungsansatz wesentliche Vorteile im Hinblick auf die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von BCS Klasse III Substanzen. Kapitel II befasst sich mit GHQ168, entwickelt von Holzgrabe et al., einer BCS Klasse II Substanz mit geringer Wasserlöslichkeit und hoher Permeabilität. GHQ168 wurde zur Behandlung der afrikanischen Schlafkrankheit entwickelt, einer tropischen Erkrankung, für die neue Arzneistoffe dringend benötigt werden. Diese Leitsubstanz bewies in Zellkulturversuchen sehr hohe Aktivität gegen Trypanosoma brucei brucei und Trypanosoma brucei rhodesiense, die geringe Wasserlöslichkeit verhinderte jedoch die weitere präklinische Entwicklung. Um diese Herausforderung anzugehen, wurden zwei verschiedene Ansätze gewählt, zum einen (I) die chemische Modifikation und zum anderen (II) die Sprühtrocknung von GHQ168. Die neu synthetisierten Derivate und das sprühgetrocknete GHQ168 wurden physikochemisch und mikrobiologisch charakterisiert. Beide Ansätze verbesserten erfolgreich die Wasserlöslichkeit, im Fall der Derivate von GHQ168 jedoch zu Lasten der Aktivität. Weiterhin wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften von GHQ168 und den aktivsten Derivaten, GHQ242 und GHQ243, untersucht. Nach intraperitonealer Applikation resultierten Halbwertszeiten zwischen 1.5 und 3.5 Stunden und eine mittlere bis hohe Plasmaproteinbindung für GHQ243 (45%) und GHQ168 (80%) und eine sehr hohe Plasmaproteinbindung für GHQ242 (> 99%). Die sprühgetrocknete Formulierung von GHQ168 sowie GHQ242 und GHQ243 wurden in zwei in vivo Studien in Mäusen, die mit t. b. rhodesiense (STIB900) infiziert waren, untersucht, die Modelle werden als (I) stringent model und (II) early-treatment model bezeichnet. Im stringent model (2x tägliche Gabe an Tag 3-6 nach Infektion) war die durchschnittliche Überlebensdauer von Mäusen, die mit sprühgetrocknetem GHQ168 behandelt worden waren, statistisch signifikant höher als die der unbehandelten Kontrollgruppe (17 gegenüber 9 Tagen). Im Gegensatz hierzu wurde kein statistisch signifikanter Unterschied für GHQ242 (14 Tage) und GHQ243 (12 Tage) festgestellt. GHQ168 wurde im early-treatment model (2x tägliche Gabe an Tag 1-4 nach Infektion) weiter untersucht und erneut wurde eine statistisch signifikante Verbesserung der durchschnittlichen Überlebensdauer (32 Tage (Ende der Beobachtungsphase) gegenüber 7 Tagen) bewiesen. Letztendlich konnte für die sprühgetrocknete Formulierung von GHQ168 eine erstaunliche Aktivität gegenüber Trypanosomen gezeigt werden. NADPH-Oxidasen (NOX) wurden als Hauptproduzenten von endothelialem reaktivem Sauerstoff erkannt. Kapitel III befasst sich mit Formulierungsstudien von Triazolopyrimidinderivaten aus der VAS-Substanzbibliothek, einer Reihe von NADPH-Oxidase-Inhibitoren. Diese Substanzen wurden zur Behandlung erhöhter reaktiver Sauerstoffspezies Werte entwickelt, denn diese tragen zur Entstehung von kardiovaskulären Erkrankungen bei. Obwohl die in vitro Ergebnisse zahlreicher Studien auf die vielversprechende Wirksamkeit und Selektivität der VAS-Substanzen hinweisen, verhinderte die geringe Wasserlöslichkeit den Übertrag auf in vivo Studien sowie die weitere präklinische Entwicklung. Daher wurden drei Derivate, VAS2870, VAS3947 und VAS4024, physikochemisch charakterisiert und VAS3947, die wasserlöslichste Substanz, wurde für weitere Formulierungsentwicklungen ausgewählt. Die Formulierungsansätze umfassten (I) die Sprühtrocknung, (II) die Herstellung von Mikroemulsionen und (III) die Komplexierung mit Cyclodextrinen, um Formulierungen für die orale und parenterale Verabreichung zu entwickeln. Die Löslichkeitsverbesserung von VAS3947 konnte für alle Ansätze erfolgreich gezeigt werden und wurde als Übersättigungsrate im Vergleich zur Löslichkeit der unformulierten Substanz dargestellt. Für sieben sprühgetrocknete Formulierungen und für vier Mikroemulsionen ergab sich eine Übersättigungsrate von 3-9, beziehungsweise von 8-19 nach 120 Minuten. Die sechs Cyclodextrin-Formulierungen erreichten mit 3-174 nach 20 Stunden die höchste Übersättigungsrate. Der Einschluss von VAS3947 in die Kavität der Cyclodextrine sowie die Interaktion mit deren Außenseite wurde mittels NMR aufgeklärt. Schließlich wurde erstmals die Möglichkeit der oralen und parenteralen Gabe der NOX-Inhibitoren eröffnet. Nach erfolgreicher Löslichkeitsverbesserung von VAS3947 wurden weitere Untersuchungen mit dem Ziel von in vivo Studien durchgeführt, was Stabilitätsuntersuchungen mit besonderem Schwerpunkt auf Stabilität in Lösung und in Plasma einschließt, wie im Kapitel IV aufgezeigt. Weiterhin wurden erstmals Permeabilitäts- und Zytotoxizitätsstudien durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass VAS3947 in Puffer und bei Lichtexposition instabil war. Zudem wurde die Substanz in Gegenwart von Maus-Mikrosomen und in menschlichem Plasma abgebaut. Die VAS-Substanzen enthalten eine Oxazol-Ringstruktur, die über einen Thioether mit dem Triazolopyrimidin-Gerüst verbunden ist. Diese Strukturelemente sind für die Wirksamkeit der Substanzklasse verantwortlich, sind jedoch auch hydrolyseempfindlich und anfällig für weitere Abbaureaktionen. Zudem schädigte VAS3947 die Membranintegrität in den Permeabilitätsversuchen und die Zytotoxizitätsuntersuchungen in HEK-293 und HEP-G2 Zellen ergaben IC50-Werte im gleichen Konzentrationsbereich wie in Aktivitätsuntersuchungen berichtet. Zusammenfassend wurde aufgezeigt, dass die VAS-Substanzen weder ein geeignetes Modell für die Untersuchung reaktiver Sauerstoffspezies sind, noch geeignet für die weitere präklinische Entwicklung