Oc2M area as a multisensory integrator : anatomical connectivity and synaptic function using in vitro optogenetics

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017To build a coherent view of the surrounding world, an organism needs to integrate multiple types of sensory information from different sources, a process known as multisensory integration (MI). Thus integrated information could be used in the formation of new memories, namely spatial memories, which can later be recalled vividly. Most of the research aimed at understanding memory formation has focused on the hippocampal formation (HF), a circuit formed by the hippocampus (HIPP), the subiculum and the entorhinal cortex (EC). Such studies established that EC and HIPP encode spatial context by storing sensory contextual information in the form of neural spatial maps. However, it remains unclear how sensory information is assembled and integrated in spatial maps, and how does memory recall elicit the vivid re-experiencing of sensory information. Previous studies have pointed to a poorly explored area in the occipital cortex, anterior to the primary visual cortex and posterior to the parietal cortex, named Oc2M, or V2M, whose lesioning impairs the acquisition of spatial memories. Furthermore, neural recordings from Oc2M suggested its involvement in multi-sensory discrimination, and in the localization of each stimulus' source. Finally, unpublished observations show that Oc2M neurons respond to the recall of memories in the HIPP during goal-directed behavior. Altogether, these data led to our hypothesis that Oc2M integrates multi-sensory inputs, sending them to HF in the service of spatial mapping. To test our hypothesis, the first question we asked was, does area Oc2M receive inputs from sensory cortices? We thus performed anatomical tracing studies aimed at identifying which brain areas project to Oc2M and where to, in the brain, does Oc2M send projections. Our data reveal that Oc2M receives inputs from all primary, and also some secondary sensory areas, as well as thalamus. Importantly, we found that Oc2M also receives/sends projections from/to the hippocampus, which is strongly suggestive of its involvement in the formation and retrieval of spatial memory. To ascertain that these projections establish functional synapses within Oc2M we used in vitro electrophysiology (classical, and using a multi-electrode array, MEA) combined with optogenetic stimulation, specifically of V1 and Au1 inputs in isolation, and also under co-stimulation. These stimuli were chosen since they are easy to manipulate and control in time and space. We injected optogenetic tools in each sensory region (V1, Au1) to stimulate each synaptic input at the destination (Oc2M), and functionally characterize the network activity resulting from its stimulation (isolated or in co-stimulation). This second part of our experimental work has shown that Oc2M, an area previously included in the secondary visual cortex, actually receives inputs from all sensory areas, and that (at least) the Au1 and V1 inputs establish functional synapses therein. Our in vitro electrophysiology data agrees with that of in vivo electrophysiology experiments in the awake-behaving rat subject to auditory and visual stimulation, currently performed in our lab. Thus, we can conclude that Oc2M area processes visual and auditory stimuli, alone or in combination, possibly conveying this information onto the HIPP, to which it projects. Given what is known so far, our data support the involvement of Oc2M area in the integration of multisensory inputs in the service of memory.Para construir uma visão coerente do mundo que nos rodeia, é necessário integrar vários tipos de informação sensorial de diferentes fontes, um processo denominado integração multissensorial (MI). A memória episódica e contextual é um de muitos exemplos de informação armazenada no cérebro com conteúdo multissensorial, que de outra forma não poderia ser armazenado de forma coerente. A informação sensorial armazenada em memória pode ser utilizada, mais tarde, no reconhecimento de locais, de faces, associações de elementos contextuais a elementos semânticos, que informam a produção de comportamentos decisionais dirigidos a um objetivo. Para compreender os mecanismos intrínsecos na formação de memórias, os investigadores têm focado o seu trabalho especialmente no hipocampo e nas áreas corticais que projetam diretamente para este, como é o caso do subículo e do córtex entorrinal. O estudo destas áreas levou à descoberta dos mapas cognitivos espaciais, constituídos essencialmente por informação sensorial de elevada complexidade e nível de abstração. No entanto, permanece sem se saber como é que estas informações sensoriais, transmitidas por outras regiões cerebrais, são direcionadas e integradas para serem convertidas em memória, sobretudo quando se sabe que a reativação de memórias nos leva a re-experienciar estímulos sensoriais com nitidez. Estudos prévios identificaram o córtex occipital secundário (Oc2M), uma área classicamente incluída no córtex visual, anterior ao córtex visual primário (V1 ou Oc1) e posterior ao córtex parietal (PC), como essencial para a aquisição de novas memórias espaciais. Registos eletrofisiológicos da atividade neuronal nesta área sugerem o seu envolvimento na discriminação de estímulos sensoriais de várias modalidades, e na localização espacial. Algumas observações não-publicadas sugerem a sua participação em comportamentos dependentes de memória contextual, e na reativação de memórias. Baseando-nos nestas evidências, levantamos a hipótese de que Oc2M integra informação multissensorial, enviando-a para o circuito de memória espacial hipocampo-córtex entorrinal. Se não existir um circuito de sinapses funcional que ligue os córtices sensoriais primários com Oc2M e este com o hipocampo, não há suporte para que a informação multisensorial chegue ao hipocampo. Assim, um primeiro passo essencial para testarmos a nossa hipótese foi estabelecer os padrões de conectividade de Oc2M com o resto do cérebro. Com este fim, realizámos estudos anatómicos, utilizando marcadores retrógrados e anterógrados (fluoróforo Alexa associado à porção B da toxina da cólera (CTB-AF) e vírus adeno-associados (AAV), respetivamente) com o objetivo de conhecer que áreas enviam projeções para Oc2M, e para onde no cérebro Oc2M envia projeções. Os marcadores foram injetados nas regiões-alvo mediante cirurgia estereotáxica, seguida de fixação in situ por perfusão intra-cardiaca, remoção do encéfalo assim fixado, seccionamento do encéfalo em fatias finas para microscopia de fluorescência simples, e posterior análise qualitativa e quantitativa das projeções relevantes utilizando software pré-definido, ou escrito por nós em linguagem Matlab. Os nossos estudos anatómicos revelam que esta região, classicamente incluída no córtex visual secundário, recebe projeções de todos os córtices sensoriais primários, de alguns córtices sensoriais secundários, de alguns núcleos do tálamo e do hipocampo. Tais resultados suportam a nossa hipótese inicial, sugerindo que esta área cortical associa estímulos primários de várias modalidades sensoriais, integrando-os anatómica, e porventura funcionalmente. Notavelmente, os nossos dados demonstram que Oc2M envia projeções para o hipocampo, sugerindo um possível envolvimento na integração de estímulos sensoriais nas memórias. Sendo duas modalidades facilmente monitorizáveis no tempo, prosseguimos os nossos estudos focando-nos apenas nas projeções dos córtices visual (V1) e auditivo (Au1) primários. Sendo o neocórtex organizado por camadas neuronais, com consequências funcionais, subsequentemente elaborámos as análises qualitativas e quantitativas das diversas regiões pertinentes de acordo com a sua estratificação anatómica. Esta análise revela que as projeções de ambas as áreas, V1 e Au1 partem das suas camadas II/III, IV e V, e convergem nas camadas II/III, IV, V e VI de Oc2M. Os resultados anatómicos obtidos foram completados com uma caracterização funcional das projeções de V1 e Au1 para Oc2M, usando eletrofisiologia in vitro em preparações de fatias corticais (que preservam o essencial do circuito neuronal de interesse). Com este objetivo, utilizámos ferramentas moleculares de optogenética mediante injeção estereotáxica em Au1 e V1, e estimulámos especificamente cada projeção, localmente em Oc2M. Estas ferramentas de optogenética são proteínas transmembranares (canais), ligadas a uma molécula opto-sensível, opsina, cuja exposição a luz de um determinado comprimento de onda leva a alterações da sua estrutura 3D, e abertura de um poro no canal de membrana, levando a que entrem e saiam eletrólitos, e a quebra do potencial de membrana no sentido excitatório, aumentando a atividade neuronal, ou inibitório, silenciando-a. Esta tecnologia permite-nos estimular especificamente cada um dos inputs sinápticos em Oc2M, iluminando a preparação com dois comprimentos de onda distintos, utilizando uma fibra ótica. Assim, caracterizamos a natureza das respostas sinápticas de Oc2M a estímulos sinápticos visuo-acústicos, isoladamente, e em co-estimulação, com o objetivo de analisar a integração cortical destes estímulos. Inicialmente executado num laboratório de eletrofisiologia clássica, com apenas um elétrodo de registo, o nosso estudo confirmou a presença em Oc2M de sinapses funcionais provenientes de V1, mas não nos permitia estudar de forma global o circuito desta região cortical, nomeadamente a distribuição anatómica das respostas funcionais à estimulação das projeções de V1 e Au1. Felizmente, e já na reta final dos nossos trabalhos, tivemos a oportunidade de utilizar uma grelha de múltiplos elétrodos (MEA, no termo original multi-electrode arrays). Esta grelha é constituída por um arranjo geométrico de 64 elétrodos distribuídos pela extensão do segmento cortical estudado, e representa uma metodologia privilegiada de análise in vitro para estudar o circuito elétrico de áreas neuronais. O estímulo e o registo dos potenciais sinápticos extracelulares são feitos de modo simultâneo em múltiplos pontos do circuito cortical, embora no nosso trabalho utilizássemos todos os elétrodos para registo, já que a nossa estimulação, foi feita por luz, conforme referido acima, proveniente de LEDs e canalizada por uma/duas fibras óticas. O equipamento utilizado, optogenética e MEA, permite observar e analisar o mapa de respostas locais à estimulação de projeções específicas vindas de outras áreas de interesse, no nosso caso as áreas V1 e Au1. Com estas experiências, observámos que Oc2M responde à estimulação isolada das projeções vindas dos córtices sensoriais primários V1 e Au1, e que responde à co-estimulação das referidas sinapses, auditivas e visuais, de acordo, mais uma vez, com a nossa hipótese inicial. A região cortical Oc2M, classificada como visual secundária, responde a estímulos visuais e auditivos, isolados ou simultâneos, estando, possivelmente, envolvida na sua integração. Os nossos estudos concordam com os resultados preliminares de estudos de eletrofisiologia in vivo, em ratos ativos e em movimento, sujeitos a estimulação visual e auditiva, atualmente em curso no laboratório. Concluindo, este trabalho vem reforçar a hipótese de que existem áreas no córtex pouco exploradas, como é o caso da área Oc2M, a quem foram classicamente atribuídas funções fundamentadas em estudos anatómicos, e que podem estar a ser subvalorizadas em relação à sua importância no processamento de informação relevante, carecendo então de uma reclassificação, quando conhecidos novos dados como os que agora apresentamos. Os nossos resultados demonstram que esta região cortical, considerada uma área visual secundária, na verdade recebe inputs de todas as áreas sensoriais primárias, comunica bidireccionalmente com o hipocampo, e exibe respostas funcionais anatomicamente coordenadas à estimulação de sinapses corticais visuais e auditivas. Oc2M pode, assim, estar envolvido na integração de estímulos multissensoriais, tendo um papel ativo no envio destas informações para o sistema de memória hipocampo-córtex entorrinal e na reativação de detalhes sensoriais da memória