Caracterización del gen de la quitinasa CHIT42 del hongo antagonista Trichoderma harzianum y análisis de su expresión en plantas de tabaco

Las especies del género Trichoderma han sido objeto de intensos estudios, dadas sus numerosas aplicaciones prácticas. Su descubrimiento tuvo lugar durante la guerra de Corea, en el sudeste asiático, como consecuencia de los destrozos que producía en las ropas de algodón de los soldados y las tiendas de campaña. Más tarde, se encontró que este hongo, actualmente denominado Trichoderma reesei, excreta una batería de células capaces de degradas la celulosa hasta obtener glucosa (Reese y Mandels, 1950). El género Trichoderma agrupa una serie de especies de hongos filamentosos saprofíticos del suelo, que, por carecer de ciclo sexual conocido, se han incluido en el grupo de los Deuteromicetos u hongos imperfectos. Recientemente, sin embargo, se ha identificado al género Hypocrea como la forma perfecta de la forma imperfecta Trichoderma, por lo cual esta clasificación es incorrecta (Samuels, 1996). La taxonomía de Trichoderma es aún muy imprecisa, dada la imposibilidad de realizar cruces genéticos con ellos. Una primera clasificación (Rifai, 1969), basada en criterior morfológicos, incluía nueve grupos o “agregados”. Más tarde, y gracias al análisis de fragmentos de restricción del DNA mitocondrial (Meyer et al., 1992), se establecieron cinco grupos que incluían nueve especies diferentes de Trichoderma: el grupo I formado por Trichoderma reesei y Trichoderma todica; el grupo II, por Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma polysporum, Trichoderma koningii y Trichoderma pseudokoninguii; el grupo III, constituido por Trichoderma virgatum; el IV, por Trichoderma saturnosporum, y finalmente, el grupo V, constituido por Trichoderma harzianum. El micelio de Trichoderma está formado por hifas tabicadas más o menos ramificadas, con células plurinucleadas. El número de cromosomas por núcleo se ha estudiado mediante técnicas de electroforesis en campo pulsante, y se han encontrado entre 5 y 7 cromosomas, según los grupos y las especies. Mäntyllä et al., 1993, encuentran 7 cromosomas en Trichoderma longibrachiatum. Herrera-Estrella et al., 1993, encuentran 6 cromosomas en Trichoderma harzianum y Trichoderma reesei, y 5 en Trichoderma viride, mientras que, según Carter et al., 1992, Trichoderma reesei tiene 7 cromosomas. Las diferencias encontradas en la misma especie puede ser una consecuencia de la inclusión artificial de diferentes cepas en la misma especie, debida a los criterios de clasificación del género, que, como se ha indicado previamente, no incluyen estudios de cruzamiento genético. Por otra parte, pueden existir cromosomas homólogos de distinto peso molecular en las especies diploides. Las especies del género Trichoderma se caracterizan por su versatilidad metabólica. Son capaces de utilizar una amplia gama de compuestos como fuente de carbono y nitrógeno, incluidos, entre otros, mono o polisacáridos, purinas, pirimidinas, aminoácidos, ácidos orgánicos e incluso metanol y formiato, como fuente de carbono, y amonio, aminoácidos, urea, nitrato o nitrito, como fuente de nitrógeno (revisado en Papavizas, 1985). Las esporas de Trichoderma, denominadas conidios, poseen generalmente un solo núcleo haploide (Rosen et al, 1974), son ovoides, de color verde, y se forman sobre estructuras ramificadas denominadas conidióforos. La esporulación es fotoinducible, es decir, tiene lugar solo en presencia de luz, preferiblemente visible o cercana al ultravioleta (Gressel y Hartmann, 1968), aunque también se puede inducir en ocasiones por falta de nutrientes (Horwitz et al., 185). Condiciones nutricionales o hídricas adversas permiten la formación de otro tipo de estructuras asexuales de resistencia, denominadas clamidosporas, cuyo papel ecológico no está lo suficientemente claro (Lewis y Papavizas, 1984). La germinación de los conidios de Trichoderma se produce en numerosos sustratos. Sin embargo, la ausencia de germinación en agua destilada indica que la iniciación de este proceso requiere una fuente externa de nutrientes (Danielson y Davey, 1973). Las clamidosporas solo son capaces de germinar en medios nutritivos (Lewis y Papavizas, 1983). La dormancia de las clamidosporas, que se interrumpe en presencia de nutrientes, es consecuente con su naturaleza de estructura de resistencia (Papavizas, 19859. Las especies del género Trichoderma son ubicuas, y viven prácticamente en cualquier tipo de suelo, especialmente en hábitats ricos en materia orgánica. Son colonizadores secundarios, como lo indica su presencia en materia orgánica en descomposición. Se encuentran también en la superficie de raíces, en cortezas, especialmente si están dañadas, y asociados a propágulos de otros hongos. A pesar de su amplio nicho ecológico, la prevalencia de Trichoderma en un determinado hábitat depende de las condiciones físico-químicas del mismo, así como de la especie analizada (revisado en Papavizas, 1985). Además de su ubicuidad y versatilidad metabólica, Trichoderma presenta una serie de características que lo convierten en un organismo de gran interés comercial. Algunas de sus especies producen grandes cantidades de celulasas, enzimas que degradan la celulosa hasta producir glucosa (Montenecourt, 1983). La utilización de las celulasas tiene gran interés en una serie de procesos industriales, como las fermentaciones alcohólicas, el procesamiento de la celulosa y el almidón, y la producción de zumos vegetales (Wood, 1989). Su capacidad de excretar proteínas y la existencia de mutantes deficientes en actividad proteasa, unidas a la existencia de métodos de transformación, convierten a este hongo en una alternativa a los organismos ya utilizados para la producción a gran escala de proteínas de mamíferos. Una prueba de ello es la eficiente expresión de la quimiosina de ternera en Trichoderma (Harkki et al., 1987). Sin embargo, la importancia del género Trichoderma estriba sobre todo en su capacidad de limitar el crecimiento y la propagación de muchos hongos patógenos de plantas, fenómeno que se denomina control biológico o bicontrol. Los agentes de control biológico se conocen desde hace más de 60 años (Weidling, 1934), y su uso en la lucha contra los hongos fitopatógenos presenta grandes ventajas frente a las técnicas tradicionales. La utilización de fungicidas químicos tiene graves consecuencias ecológicas puesto que normalmente destruyen una más o menos amplia gama de microorganismos que incluye al fitopatógeno. Puede, además, repercutir negativamente en la salud de los animales que ingieren las plantas tratadas, incluido el hombre. Además, existe la necesidad de renovar en cada cosecha el pesticida utilizado, y en ocasiones, alternar su uso con otros, puesto que pueden surgir cepas de patógenos resistentes (Cornelissen et al., 1993). Esto tiene serias repercusiones económicas: solo en Europa, el coste del tratamiento del trigo con pesticidas se ha estimado en más de 80 millones de ECUs anuales (Lamb et al., 1992). Los países en vías de desarrollo o subdesarrollados, más necesitados, además, de una agricultura sostenible, son los principales perjudicados en este sentido. Frente a este control tradicional de las enfermedades producidas por hongos en las plantas, el control biológico parece reunir todas las ventajas. En líneas generales, el biocontrol altera el ambiente que rodea un cultivo para favorecer a los organismos que contribuyen a su salud y vigor (Cook y Baker, 1983). Por otra parte, el agente de control biológico es capaz de impedir el crecimiento y desarrollo de los organismos patógenos, fenómeno denominada antagonismo, y que es de vital importancia en el proceso global de biocontrol. En muchas ocasiones, el agente de control biológico es capaz de crecer y colonizar partes de la planta como el sistema radicular, protegiéndolo de los fitopatógenos. Además, a veces, el agente de biocontrol favorece el crecimiento de la planta, obteniéndose mayores rendimientos además de la ventaja que supone el control directo de la enfermedad. Por otra parte, la localización restringida del agente de biocontrol alrededor de la raíz minimiza la presión de selección que favorecería la aparición de especies de fitopatógenos resistentes (Handelsmann y Stabb, 1996). Varias especies de Trichoderma han sido descritas como antagonistas de una amplia variedad de hongos fitopatógenos (Papavizas, 1985). Ya Weindling, en 1932, sugirió que se podría controlar una serie de hongos patógenos por adición al suelo de inóculos de este hongo. De hecho, Tricoderma presenta una serie de características muy ventajosas para su utilización como agente de control biológico (revisado por Jeffries y Young, 1993). En primer lugar, presenta un efecto antagónico contra una gran variedad de hongos patógenos de plantas. Además, crece muy rápidamente, necesita pocos nutrientes para su desarrollo, y es capaz de vivir en suelos ácidos y básicos. Tras fumigar un suelo, Trichoderma se recupera rápidamente y recoloniza el suelo tratado. Produce abundantes esporas, y necesita pocos requerimientos para germinar. Por otra parte, Trichoderma favorece la formación y el desarrollo de las micorrizas, y estimula directamente el crecimiento de las plantas en ausencia de hongos patógenos, produciendo o estimulando la producción de fitohormonas. De hecho, se ha utilizado como suplemento en una variada gama de cultivos hortícolas (Baker, 1989). Las especies del género Trichoderma, y la especie afín Gliocladium virens (recientemente reclasificada como Trichoderma virens) han sido utilizadas en numerosas ocasiones como agentes efectivos de control biológico