Comet Assay nello studio della radiosensibilità in pazienti con Atassia Telangiectasia (AT), Atassia Telangiectasia Variante (ATLD) e Nijmegen Breakage Sindrome (NBS).

L’AT, ATLD ed NBS sono malattie a trasmissione autosomica recessiva che possono esser comprese nelle malattie da difetto di riparo del DNA. Pur presentando molti tratti clinici diversi, hanno un fenotipo cellulare quasi sovrapponibile il cui tratto più importante è la radiosensibilità.. Alla base della radiosensibilità di questi pazienti c’è l’instabilità genomica dovuta al mancato riparo delle rotture del DNA a doppio filamento. Infatti, i geni responsabili di queste patologie, rispettivamente ATM, Mre11, NBS1 sono coinvolti nello stesso pathway metabolico che porta al riparo delle rotture del DNA a doppio filamento. Le rotture a doppio filamento prodotte mediante radiazioni ionizzanti o sostanze radiomimetiche, producono un cambiamento conformazionale nella cromatina che porta alla autofosforilazione di ATM, alla sua attivazione come chinasi ed alla conseguente attivazione di diverse proteine bersaglio tra le quali l’istone H2AX, che funziona da segnale di rottura a doppio filamento e, di NBS1 che fosforilato lega Mre11/Rad50, si lega ai DSBs e interviene nel riparo di questi. Allo scopo di correlare radiosensibilità e mutazioni identificate nei diversi geni del complesso Mre11/NBS/Rad50 è stata messa a punto la tecnica del Comet assay. Circa 30.000 cellule derivate LCLs di un paziente AT classico, AT variante e di una linea di controllo normale sono state irradiate, risospese in agarosio, sottoposte ad elettroforesi e colorate con bromuro d’etidio. In queste condizioni il DNA danneggiato tende a migrare verso l’anodo. Le cellule che contengono DNA non danneggiato appaiono come formazioni rotondeggianti (nucleoidi intatti) formate dal DNA superavvolto che non è migrato, mentre i filamenti di DNA rilassato dai DSBs, migrano verso le maglie del gel formando delle “comete” la cui lunghezza è direttamente proporzionale all’entità del danno prodotto a quella determinata dose di RI. La valutazione dei diversi parametri che quantificano l’entità del danno subito dopo l’irradiazione e a 24h dall’induzione del danno stesso ci ha permesso di verificare la capacità minima residua di riparare delle diverse linee cellulari analizzate. L’utilizzo di questo saggio per lo studio di queste malattie da difetto di riparo del DNA ci permetterà di attribuire un significato funzionale alle mutazioni identificate nei membri del complesso che controllano il riparo delle rotture del DNA a doppio filamento