Evolutionary engineering of polyhydroxyalkanoates producing bacteria

Diplomová práce se zabývá aplikací evolučního inženýrství na PHA produkující kmeny. Cílem práce je připravit prostřednictvím metod evolučního inženýrství kmeny adaptované na kyselinu levulovou, jakožto vybraný stresový faktor, a následně tyto kmeny charakterizovat. Teoretická část práce se zabývá především evolučním inženýrstvím a polyhydroxyalkanoáty. Pro evoluční experimenty byl využit bakteriální kmen Cupriavidus necator H16. Za účelem přípravy adaptovaných kmenů byla aplikována jednak samotná kyselina levulová, jednak kyselina levulová v přítomnosti mutagenu MMS. Selekce vhodných mutantů byla posuzována na základě růstového potenciálu a obsahu PHA v biomase. U pěti získaných PHA produkujících adaptovaných mutantů a kontroly byly prostřednictvím metod GC-FID, SEC-MALS, DSC a FT-IR charakterizovány vyizolované polymery. Bylo zjištěno, že vyšší obsah 3HV v kopolymeru vedl k nižší krystalinitě a tím i k nižší teplotě tání, z trendu se vymykal pouze kopolymer kmene M0151. Kromě charakteristik polymerů byly z biochemického hlediska posuzovány i samotné kmeny, a to prostřednictvím stanovování aktivit vybraných enzymů citrátového, glyoxalátového a 2-methylcitrátového cyklu, vybraných enzymů generujících NADPH, enzymu katabolismu kyseliny levulové a enzymů biosyntézy PHA. Na základě získaných dat byly diskutovány možné adaptační strategie, kdy se nejvíce odlišovat kmen E0575. Hodnoty specifických enzymových aktivit byly podrobeny metodám statistické analýzy AHC a PCA.This diploma thesis deals with the application of evolutionary engineering to PHA producing bacterial strains. The aim of the thesis is to prepare strains adapted to levulinic acid, a selected stress factor, by methods of evolutionary engineering, and then to characterize these strains. The theoretical part deals with evolutionary engineering and polyhydroxyalkanoates predominantly. The bacterial strain Cupriavidus necator H16 was used for evolutionary experiments. Levulinic acid and levulinic acid in the presence of the MMS mutagen were applied to prepare adapted strains. Selection of mutants was evaluated on the basis of growth potential and PHA content in biomass. Polymers produced by five obtained PHA-producing mutants and control were characterized using GC-FID, SEC-MALS, DSC and FT-IR. It was found that a higher content of 3HV in the copolymer led to a lower crystallinity and hence to a lower melting point, nevertheless, only the copolymer of the M0151 strain did not fit this trend. In addition to the characteristics of the polymers, the strains themselves were evaluated from the biochemical point of view by determining the activities of selected enzymes of the citrate, glyoxalate and 2-methylcitrate cycle, selected enzymes generating NADPH, levulic acid catabolism enzyme and PHA biosynthesis enzymes. On the basis of the obtained data, the possible adaptation strategies were discussed, when the E0575 strain was most differentiated from original culture. Values of specific enzyme activities were subjected to AHC and PCA statistical analysis methods.