Synaptic competition in the amygdala : heterosynaptic plasticity between thalamic and cortical projections to the lateral amygdala

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2018Aprender e a principal propriedade do cerebro atraves da qual, com base na experiencia, os animais se adaptam as caracteristicas do ambiente envolvente. Embora cada evento de aprendizagem possa ser considerado como um novo processo de formacao de memorias, existem evidencias de que as memorias sao formadas sobre uma rede de informacoes pre-existentes. E comumente aceite que as memorias evoluem ao longo do tempo, sendo que, logo apos a aprendizagem, as memorias sao instaveis e suscetiveis de serem modificadas ou perdidas por interferencia de eventos concorrentes. Estas sao chamadas memorias de curta duracao (short-term memories – STM), em que atraves de um processo dependente da sintese de novas proteinas denominado por consolidacao, sao estabilizadas em memorias de longa duracao (long-term memories – LTM). A reativacao das LTM torna-as instaveis pelo que para se tornarem novamente estaveis, necessitam de ser reconsolidadas, atraves de um processo denominado por reconsolidacao. Apos a reativacao de uma memoria existe um processo alternativo, definido como extincao, que resulta de uma exposicao mais prolongada e diminui a expressao da memoria inicial. Assim, apos a reativacao de uma memoria adquirida, a sua expressao pode ser mantida ou aumentada por reconsolidacao, ou reduzida por extincao. Neste contexto, a reativacao de memorias previamente consolidadas, apos a aquisicao de novas memorias, pode resultar na manutencao de uma LTM por mecanismos de cooperacao, ou no seu enfraquecimento por competicao. Os modelos celulares mais aceites que explicam a formacao de memorias traduzem alteracoes na forca das sinapses e consistem em modelos de plasticidade sinaptica. Nestes, formas duradouras de plasticidade de sinaptica, como a potenciacao de longa duracao (long-term potentiation – LTP), tambem sao caracterizadas como tendo diferentes etapas. Mais concretamente, formas transientes de LTP podem serem relacionadas com as STM, e formas persistentes de plasticidade (que sao mais estaveis e dependem de sintese proteica) podem ser relacionadas com as LTM. Esta visao de que formas persistentes de LTP dependem de sintese proteica, e que a inducao de LTP so ocorre em sinapses previamente ativadas, sugere que as sinapses sao marcadas por um sinal molecular local (tag), com o objetivo das proteinas associadas a plasticidade (plasticityrelated proteins – PRPs) serem alocadas. Assim, dado que a plasticidade sináptica depende da alocacao de PRPs e que as sinapses partilham as PRPs disponiveis, para que formas persistentes de plasticidade sejam induzidas, as sinapses terao de cooperar ou competir entre si. Com o intuito de compreender melhor de que forma estes mecanismos de cooperacao e de competicao sinaptica interferem no processo de formacao de memorias, o nosso grupo decidiu estudar estes mecanismos de plasticidade sinaptica na amigdala, mais concretamente na amigdala lateral (lateral amygdala – LA). A LA e as suas vias aferentes talamicas e corticais formam um circuito necessario para a formacao de memorias condicionadas pelo medo (fear conditioning memories). Dado que este circuito se encontra muito bem descrito sob o ponto de vista anatomico e comportamental, e um modelo que permite ligar a fisiologia celular com o comportamento. O principal modelo celular subjacente ao paradigma de condicionamento por medo auditivo (auditory fear conditioning) consiste numa forma de LTP induzida pela associacao entre as projecoes talamicas auditivas e corticais auditivas (estimulo condicionado/ conditioned-stimulus – CS) e o estimulo nociceptivo (estimulo nao condicionado/ unconditioned-stimulus – US). Estudos recentes do nosso grupo demonstraram que as sinapses corticais e talamicas cooperam, resultando na manutencao de formas transientes de LTP por partilha de PRPs entre os dois grupos de sinapses ativadas, e no reforco de ambos os inputs de um modo associativo. Este mecanismo de cooperacao demonstra ser bidirecional e ocorrer dentro de uma janela temporal prolongada. Contudo, esta partilha revela ser assimetrica dado o facto da capacidade das sinapses talamicas capturarem PRPs decair muito mais rapidamente comparativamente com as sinapses corticais. Alem disso, demonstrou-se que a janela temporal da cooperacao talamica e limitada pela ativacao do receptor cannabinoid 1 (CB1), em que a inibicao dos receptores dos endocanabinoides permite estender a janela de cooperacao cortico-talamica. Com a realizacao deste trabalho pretendemos abordar, a nivel celular, de que forma os mecanismos de cooperacao e de competicao contribuem para a formacao e manutencao de memorias, utilizando como modelo de aprendizagem a formacao de memorias de medo associativo (associative fear memories). Assim, o primeiro objetivo deste trabalho consistiu em testar se as sinapses talamicas e corticais interagem por cooperacao sinaptica, e confirmar que este mecanismo e dependente de sintese proteica. Seguidamente, pretendeu-se testar se estas mesmas sinapses interagem por competicao sinaptica, determinar quais as regras temporais desta forma de plasticidade e qual o impacto da modulacao da ativacao dos recetores CB1. Para testar as hipoteses acima referidas, recorremos a tecnica de patch-clamp em current-clamp, na configuracao whole-cell, e registamos potenciais excitatorios pos-sinapticos em neuronios piramidais na LA, desencadeados pela estimulacao dos inputs talamicos e corticais. Numa primeira abordagem, a associacao das vias corticais e talamicas foi testada atraves da coativacao dos inputs talamicos e corticais, por estimulacoes fracas (tetanus fracos). Verificamos que o LTP das duas vias nao se revelou persistente ao longo do registo. De seguida optamos por associar uma estimulacao cortical forte (tetanus forte) sucedida por uma estimulacao talamica fraca, e desta forma confirmamos a existencia de cooperacao sinaptica. Com recurso a um inibidor da sintese proteica, comprovamos que este mecanismo e dependente de sintese proteica. Com a estimulacao de uma projecao talamica adicional (por um tetanus fraco), foi possivel verificar que as sinapses talamicas e corticais competem quando e gerado um desequilibrio entre o numero de sinapses ativadas e a quantidade de PRPs disponiveis. Demonstramos que a competicao sinaptica e modulada pelo tempo, pois o aumento da janela temporal (30-min) da segunda estimulacao talamica diminuiu a competicao sinaptica, e que esta esta relacionada com a disponibilidade reduzida de PRPs. A semelhanca da cooperacao, a ativacao dos receptores CB1 tambem modula a competicao sinaptica. Relativamente a este ultimo aspeto, a inibicao dos receptores CB1 leva a um aumento da competicao; e um aumento da ativacao dos receptores CB1, por aumento da disponibilidade de endocanabinoides, resulta numa diminuicao da competicao. O facto dos receptores CB1 modularem a forca do tag das sinapses talamicas podera explicar estes resultados. Verificamos ainda que tanto a competicao como a cooperacao resultam de um balanco entre a excitacao e a inibicao, uma vez que inibindo os recetores GABAA (Gamma- Amino Butyric Acid) a cooperacao e facilitada. Assim, os nossos resultados demonstram que os inputs corticais e talamicos para a LA podem interagir entre si dentro de determinadas janelas temporais, competindo quando a disponibilidade de PRPs e o numero de sinapses se encontra desequilibrada. Um aspeto interessante e a possivel relacao com a aprendizagem discriminativa, quando um animal aprende a discriminar um CS+/US de uma associacao CS-/US. Nesta situacao, os neuronios piramidais da LA aumentam as suas respostas ao CS+ e mostram uma diminuicao paralela no CS-. Uma das hipoteses baseia-se no facto desta diminuicao da CS-resposta ser resultante de mecanismos de competicao sinaptica que ocorrem durante a aprendizagem. Em concordancia com este mecanismo, o aumento da disponibilidade de PRPs diminui a aprendizagem discriminativa. Estas observacoes geram um grande impacto na estrutura conceptual da aprendizagem de medo associativa (associative fear learning), uma vez que fornecem um mecanismo celular para a integracao continua da informacao nas sinapses da LA. Alem disso, ao trabalhar numa area do cerebro bem caracterizada sob o ponto de vista comportamental, este projeto oferece a possibilidade de integrar informacoes de diferentes niveis de investigacao, conduzindo a uma visao unificadora da formacao de memorias.Learning is the main property of the brain through which, based on experience, animals learn to adapt to the characteristics of the environment. Although each learning event can be considered as a new memory formation process, there is evidence that memories are formed over a network of preexisting information. It is commonly accepted that memories evolve over time, and soon after learning, memories are unstable and susceptible to be modified or lost by interference from competing events. The most accepted cellular models that explain memory formation translate the changes in the strength of the synapses, and consist of models of synaptic plasticity. Longterm potentiation (LTP) requires input-specific allocation of plasticity-related proteins (PRPs) for its maintenance. This view that persistent forms of LTP depend on protein synthesis, as well as the induction of LTP only occurs in previously activated synapses, suggests that these synapses are marked by a local molecular signal (tag), allowing PRPs to be allocated. Thus, since synaptic plasticity depends on the allocation of PRPs, in which synapses share the available PRPs, to induce persistent forms of plasticity synapses will have to cooperate or compete. In order to better understand how synaptic cooperation and competition are orchestrated as well as their implication in memory formation, we have studied the interaction between the cortical and thalamic afferents to projection neurons of the lateral amygdala (LA). This circuit is known to be involved in the formation of fear conditioning memories. The leading cellular model underlying auditory fear conditioning is a form of Hebbian LTP, induced by the association between the auditory thalamic and auditory cortex projections (conditioned-stimulus – CS) and the nociceptive input (unconditioned-stimulus – US). Recent studies from our group have demonstrated that cortical and thalamic synapses cooperate, resulting in the maintenance of transient forms of LTP by sharing PRPs between these groups of activated synapses. In addition, the temporal window for thalamic cooperation is limited by the activation of the cannabinoid 1 (CB1) receptor. The goal of this work was to assess, at the cellular level, how the mechanisms of cooperation and competition contribute to the formation and maintenance of memories, based on associative fear learning. Thus, the first objective of this work was to test whether thalamic and cortical synapses interact through synaptic cooperation, and confirm that this mechanism depends on protein synthesis. Next, we wanted to test if these synapses interact by synaptic competition, uncover what are the temporal rules of this form of plasticity and assess the impact of eCBs receptors activation. We recorded excitatory post-synaptic potentials in pyramidal neurons in the LA, evoked by stimulation of thalamic and cortical inputs. We found that cortical and thalamic synapses can cooperate by sharing PRPs, resulting in the re-enforcement of both inputs. Nevertheless, thalamic and cortical synapses also compete. The stimulation of an additional thalamic projection leads to an unbalance between the number of activated synapses and PRPs availability, resulting in competition. Synaptic competition is modulated by time, whereas extending the time window decreases synaptic competition, and depends on the reduced availability of PRPs. Interestingly, we have further found that both competition and cooperation result from a balance between excitation and inhibition since GABAA receptors blockage enhances cooperation. Activation of the endocannabinoid receptor CB1 (CB1R) also modulates synaptic competition – increased activation of CB1R decreases competition and CB1R blockage enhances competition. Our results show that cortical and thalamic inputs to the LA can interact with each other within large time windows, competing when the availability of PRPs and the number of activated synapses is unbalanced. This observation has a profound impact on the conceptual framework of associative fear learning, as it provides a cellular mechanism for continuous integration of information at amygdala synapses