Investigation Of Antioxidant Capacity Of Hackberry (celtis Australis L.) And Laurel (prunus Laurocerasus) Fruits

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2015Serbest Radikaller, üzerinde elektron fazlalığı veya eksikliği nedeniyle yüklü olan kimyasal olarak aktif atom veya moleküllerdir. Biyolojik sistemlerde en çok önem teşkil eden serbest radikal olarak oksijen kaynaklı radikaller gösterilebilir. Vücuttaki virüs ve bakterileri etkisiz hale getirmek için bağışıklık sistemi içine konulan mekanizmalardan biri de serbest radikallerin üretimidir. Her şeyde bir denge olduğu gibi bu mekanizmaların sağlıklı işletilmesinde de dengeli üretim çok önemlidir. Eğer serbest radikal üretimi fazlaysa ve koruyuculukla vazifeli antioksidan gibi moleküller de yoksa veya yeterli değilse, bu durum canlı hücrelerde tahribata neden olmaktadır. Serbest radikaller hem vücudun içinde hem de dışındaki etkenler tarafından meydana gelir. Oksijenli solunum, metabolizma ve enfeksiyon gibi vücut içinden kaynaklanan olayların yanında; sigara, alkol, x-ışınları, güneş ışını ve kirlilik gibi dış kaynaklı çevresel faktörlerin etkisiyle de serbest radikaller oluşur. Sigara ve alkol yanında strese bağlı olarak da vücutta bu moleküllerin üretimi gerçekleşmektedir. İnsanlar ister gıda maddeleri vasıtası ile olsun ister metabolik olaylar sonucu olsun, her zaman bu dejeneratif moleküllerle karşı karşıya bulunur. Serbest radikaller vücudun her yerinde elektron verir yada alabilirler. Böylelikle hücreler, proteinler ve DNA’ya zarar verebilirler. Serbest radikaller DNA moleküllerine bağlanıp onda zararlı değişikliklerin ortaya çıkmasını tetikleyerek kansere sebep olabileceği gibi pankreasta yoğunlaşarak şeker hastalığına, gözde katarakta, kanda ise kalp ve dolaşım sistemi hastalıklarına sebep olabilir. Alınacak önlemler bunların vücuttaki zararlı tesirlerini en aza indirilebilir veya önleyebilir. Antioksidanlar serbest radikallerle reaksiyona girerek (onlarla bağ kurarak) hücrelere zarar vermelerini önler. Bu özellikleriyle hücrelerin anormalleşme ve sonuç olarak tümör oluşturma risklerini azalttıkları gibi, hücre yıkımını da azalttıkları için, daha sağlıklı ve yaşlılık etkilerinin minimum olduğu bir hayat yaşama şansını yükseltirler. Antioksidanlar; serbest radikalleri etkisiz hale getirerek oksidasyon prosesini engelledikleri esnada kendileri okside olurlar. Bu sebeple vücudumuzun antioksidanlara sürekli olarak ihtiyacı vardır. Antioksidan özelliği keşfedilen birçok farklı madde vardır. Bu maddelerin bir kısmını diyetimizde (özellikle bitkilerden) alırken, bir kısmını vücut kendisi, serbest radikallere karşı bir savunma sistemi olarak üretir. Vücudun serbest radikallere karşı savunma olarak ürettiği antioksidanlar; katalaz, glutatyon peroksidaz, ve SOD (süperoksit dismutaz) gibi enzimlerdir. Bu çalışmamızda Çitlembik ve Karayemiş meyvelerinin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çitlembik meyvesinin antioksidan kapasitesi ile ilgili yapılan çalışmalar sınırlı sayıdadır. Daha önce yapılan çalışmalar daha çok çitlembik yapraklarının hava kalitesi üzerine etkileri, çitlembik ağacı kabuk ve yapraklarının havadaki ağır metal konsantrasyonunun belirlenmesinde biyomonitör olarak kullanılması ile ilgilidir. Çitlembik meyvesinin antioksidan kapasitesi ile ilgili çalışmaların çok az olması ve çitlembik türlerinin ülkemiz coğrafyasında geniş yayılım göstermesi bu çalışmanın hayata geçirilmesinde etkili olmuştur. Antioksidan tayin yöntemleri çitlembik meyvesinin olgunlaşma evresi boyunca dönüştüğü yeşil, sarı ve siyah hallerine uygulanarak çitlembiğin gelişimi boyunca antioksidan kapasitesindeki değişimi ve mevcut değişimin sebeplerini belirlemek amaçlanmıştır. Bunun yanında Karayemiş meyvesi antioksidan kapasitesi de analiz edilmiştir. İstanbul Teknik Üniversitesi ve Trabzon’un Araklı ilçesinden aynı tarihte karayemiş örnekleri toplanarak farlı yörelerde yetişen aynı türlerin kapasiteleri kıyaslanmıştır. Karayemiş meyvesinin antioksidan kapasitesi ile ilgili daha önce yapılan çalışmalar mevcuttur ancak bu çalışmada kullanılan farklı antioksidan tayin yöntemleri ile Karayemiş antioksidan kapasite sonuçları desteklenmiştir. Çalışmamızda CUPRAC, CERAC, Folin-Ciocalteu ve SDS ile modifiye edilmiş Ferrisiyanür antioksidan kapasite tayin yöntemleri kullanılmıştır. Bu yöntemleri uygulamak amacıyla öncelikle Çitlembik meyvesinin ekstrakları ve infüzyonu ile Karayemiş meyvesinin ekstraktları hazırlanmıştır. CUPRAC yöntemi hazırlanan ekstraktlara uygulanırken; toplamda 4,1 mL olacak şekilde numune ekstraktlarına saf su, 1 mL 1,0 × 10-2 M CuCl2, 1 mL 7,5 × 10-3M neokuproin ve 1 mL NH4Ac olmak üzere reaktif çözeltileri eklenerek reaksiyonun gerçekleşmesi için 30 dakika beklenmiştir. Cu(I) neokuproin kelatının maksimum absorbans yaptığı 450 nm dalga boyunda absorbans ölçümleri alınmış ve 3 kez tekrarlanmıştır. CERAC yöntemi ile yapılan analizlerde; 1×10-3 M troloks çözeltisinden değişik miktarlarda alınıp 1mL 2 x 10-3 M Ce(IV) çözeltisi, 7 mL 1 M Na2SO4 çözeltisi ve toplam hacim 10 mL olacak şekilde saf su ve numune ekstraktları ilave edilip reaksiyonun gerçekleşmesi için 30 dakika beklenmiştir. Ce(IV)’ün maksimum absorbans yaptığı 320 nm dalga boyunda absorbans ölçümleri alınmış ve ölçümler 3 kez tekrarlanmıştır. Folin-Ciocalteu yöntemi ile yapılan analizlerde; x mL numune çözeltisi + (2-x) mL su + 2,5 mL Lowry C eklenerek karışım 10 dakika bekletildikten sonra üzerine 1:3 oranında seyreltilmiş 0,25 mL Folin reaktifi ilave edilerek oda sıcaklığında 30 dakika bekletilmiştir. Diğer yöntemlerde olduğu gibi ölçümler 3 kez tekrarlanmıştır. SDS ile modifiye edilmiş Ferrisiyanür yönteminde ise x mL antioksidan + (1-x) mL mutlak EtOH + 6,3 mL H2O + 0,2 mL 1 M HCl + 1,5 mL 1% (w/v) K3Fe(CN)6 + 0,5 mL 1% (w/v) SDS + 0,5 mL 0,2 % (w/v) FeCl3.6H2O; toplam hacim 10 mL olacak şekilde karıştırılmış ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletildikten sonra 750 nm de (A750) köre karşı absorbansları ölçülmüştür. Ölçümler 3 kez tekrarlanmıştır. Çitlembik ekstraklarını hazırlamak amacıyla çitlembik meyve numuneleri İTÜ Ayazağa Kampüsünden toplanmıştır. Çitlembik çekirdek ve meyve kısmı birbirinden ayrılmış ve havanda toz haline getirilmiştir. Çözücü olarak % 80’lik (v/v) metil alkol kullanılmış ve çalkalayıcıda (toplam 2 saat olmak üzere çitlembik meyve ve çekirdek kısımları ayrı ayrı) 350 rpm’ de çalkalanarak ekstrakte edilmiştir. Daha sonra yapılan tüm çitlembik meyvesi ekstraksiyon ve infüzyon işlemleri bu şartlar altında (toplam 2 saat ve 350 rpm hızda ) gerçekleştirilmiştir. CUPRAC yöntemi kullanılarak elde edilen sonuçlara göre Çitlembik çekirdek kısmında Çitlembik meyve kısmına nazaran çok daha düşük antioksidan kapasite gözlemlenmiş ve daha sonraki çalışmalara Çitlembik meyve kısmıyla devam edilmiştir. Çitlembik meyvesi ekstraksiyonu için uygun çözücü cinsi belirlenmeye çalışılmış bu amaçla ekstraksiyon çözücüsü olarak etanol, metanol ve aseton seçilmiştir. Ekstraktlar hazırlanmadan önce Çitlembik meyvesi kısmı çekirdeğinden ayrılarak 3 gün oda sıcaklığında kurumaya bırakılmış ve kuruduktan sonra havanda toz haline getirilerek numune hazırlanmıştır. Etanol, metanol ve aseton çözücüleri kullanılarak hazırlanan Çitlembik ekstraktlarına CUPRAC yöntemi uygulanmıştır. Antioksidan kapasite sırasına göre sonuçlar %70’lik (v/v) aseton > %80’lik (v/v) metanol > %80’lik (v/v) etanol > mutlak metanol > mutlak etanol şeklindedir. Çözücü optimizasyonu çalışmalarında mutlak, %80, %70, %50, %40 ve %25’lik (v/v) metanol kullanılarak çitlembik ekstraktları hazırlanmış ve bu ekstraktlara CUPRAC yöntemi uygulanarak en yüksek antioksidan kapasiteye 0,072 (mmol TR/g) değeriyle %50’ lik (v/v) metanol ile hazırlanan ekstraktların sahip olduğu görülmüştür. Çitlembik meyvesinin olgunlaşma evresi boyunca dönüştüğü yeşil, sarı ve siyah halleri için %50’ lik (v/v) metanol ile ekstraktlar hazırlanmış bununla beraber yeşil, sarı ve siyah çitlembik meyvelerinin infüzyonları da hazırlanmıştır. %50’ lik (v/v) metanol ekstraktları ve infüzyonlarına CUPRAC, CERAC, Folin-Ciocalteu ve SDS ile modifiye edilmiş Ferrisiyanür yöntemleri uygulanmış ve her yöntem sonucunda antioksidan kapasite miktarları mmol TR/g olmak üzere yeşil > sarı > siyah şeklinde belirlenmiştir. Bunun yanında uygulanan 4 yöntem için de antioksidan kapasite miktarları mmol TR/g olmak üzere çitlembik % 50 metanol ekstratı > çitlembik infüzyon olduğu görülmüştür. Karayemiş meyvesi antioksidan kapasitesi belirlenmesinde İstanbul Teknik Üniversitesi Ayazağa kampüsünden (İST KRY) ve Trabzon’un Araklı ilçesinden (TR KRY) toplanan karayemiş meyveleri kullanılmıştır. Karayemiş meyveleri İST KRY ve TR KRY ayrı ayrı çekirdeklerinden ayrılarak parçalayıcıdan (blender) geçirilmiş, çekirdekler havanda toz haline getirilmiştir. Çözücü olarak % 80’lik (v/v) metil alkol kullanılmış ve sheaker toplam 2 saat olmak üzere karayemiş meyve ve çekirdek kısımları ayrı ayrı 350 rpm’ de çalkalanarak ekstrakte edilmiştir. CUPRAC yöntemi kullanılarak elde edilen sonuçlara göre Karayemiş çekirdek kısmında Karayemiş meyve kısmına nazaran çok daha düşük aktivite gözlemlenmiş ve daha sonraki çalışmalara Karayemiş meyve kısmıyla devam edilmiştir. Farklı kurutma yöntemlerinin, karayemiş meyvesinin antioksidan kapasitesi üzerine etkisinin incelenmesi amaçlanmış ve numune olarak TR KRY meyveleri kullanılmıştır. TR KRY çekirdeklerinden ayrılıp meyvesi parçalayıcı ile homojenize edilmiş ve her biri 2 g örnek içermek üzere 3 ayrı seri oluşturulmuştur. 3 numune liyofilizasyon işlemi için liyofilizere konulmuş (LİYO), 3 numune üzerine yaşken çözücü eklenmiş ve ekstrakte edilmiş (YAŞ), 3 numune gün ışığında kurutulmak üzere saat camı üzerine yayılmıştır. (Kurutma işlemi oda şartlarında 3 gün sürdü.)(ODA SICAKLIĞI) Her bir TR KRY meyve örneği ayrı ayrı ekstrakte edilmiştir. Bu ekstraksiyon işleminde her seri için çözücü olarak %70’lik (v/v) aseton, %80’lik (v/v) metanol ve %80’lik (v/v) etanol kullanılmıştır. CUPRAC yöntemiyle belirlenen sonuçları, kurutma yönteminin antioksidan kapasite üzerine etkisi açısından, antioksitan kapasiteleri mmol TR/g cinsinden YAŞ > LİYO > ODA SICAKLIĞI şeklinde sıralayabiliriz. Aynı testlerin sonucundan yola çıkarak çözücü seçimi de yapılmış % 70 aseton > %80 metanol > % 80 etanol sıralamasının yanı sıra aseton kullanımının yapılacak diğer çalışmalarda kısıtlayıcılığının olabileceği düşüncesiyle çözücü olarak metanol kullanılmasına karar verilmiştir. Farklı ekstraksiyon yöntemlerinin verimliliğini belirlemek amacıyla da çalışmalar yapılmıştır. Tüm çalışmamız boyunca kullandığımız standart ekstraksiyon yöntemi (ekstraksiyon 1) ile birlikte TR KRY meyvesine farklı bir ekstraksiyon yöntemi (ekstraksiyon 2) uygulanmıştır. Bu yöntemde çekirdeğinden ayrılan parçalayıcı ile homojenize edilmiş 5 g TR KRY alınmış ve 25 mL %80’lik (v/v) metanol ekenerek bir gece boyunca ağzı kapaklı şiliftli erlen içerisinde bekletilmiştir. 16 saat beklemiş olan karayemiş ekstraktı 10 dk. vortekslenerek siyah bant süzgeç kağıdından süzülmüş ve bu işlem 3 kez 25 mL %80 (v/v)’lik metanol ile tekrarlamıştır. Son hacim çözücüsüyle 100 mL’ye tamamlanarak farklı ekstraksiyon yöntemleri ile hazırlanmış iki ekstrakta da CUPRAC yöntemi uygulanmıştır. Antioksidan kapasite sırasına göre sonuçlar ekstraksiyon 2 > ekstraksiyon 1 şeklindedir. Karayemiş meyvesi ekstraksiyonu için uygun çözücü cinsi belirlenmeye çalışılmış bu amaçla ekstraksiyon çözücüsü olarak etanol, metanol ve aseton seçilmiştir. TR KRY ile hazırlanan ekstraklara CUPRAC yöntemi uygulanmıştır. Antioksidan kapasite sırasına göre sonuçlar %70 (v/v)’lik aseton > %80 (v/v)’lik metanol > mutlak metanol > mutlak etanol > %80 (v/v)’lik etanol şeklindedir. Daha sonra yapılacak farklı çalışmalarda kullanılacak cihazlarda kullanım açısından herhangi bir kısıtlama ya da sorunla karşılaşılmaması amacıyla çözücü olarak metanol kullanılmasına karar verilmiştir. Çözücü optimizasyonu çalışmalarında ise mutlak, %80, %70, %50, %40 ve %25’lik (v/v) metanol kullanılarak ayrı ayrı İST KRY ve TR KRY ekstraktları hazırlanmış ve bu ekstraktlara CUPRAC yöntemi uygulanarak İST KRY ekstraklarından en yüksek antioksidan kapasiteye %50’ lik (v/v) metanol TR KRY ekstraklarından % 70’ lik (v/v) metanol ile hazırlanan ekstraktların sahip olduğu belirlenmiştir. Aynı testlerin sonuçlarından yola çıkarak kıyaslama yapabilmek amacıyla %50’lik (v/v) metanol kullanılarak TR KRY ve İST KRY ekstrakları tekrar hazırlanmış ve bu ekstraktlara CUPRAC, CERAC, Folin-Ciocalteu ve SDS ile modifiye edilmiş Ferrisiyanür yöntemleri uygulanmıştır. Her yöntem sonucunda antioksidan kapasite miktarları mmol TR/g olmak üzere İST KRY > TR KRY şeklinde belirlenmiştir.Free radicals, as charged chemicals due to excess or deficiency of electrons, are chemically active atoms or molecules. Oxygen sourced radicals can be represented as the most import free radicals in biological systems. One of the mechanisms put into immune system to neutralize viruses and bacteria in the body is production of free radicals. As so most of the stable systems, balanced production is substantial for these mechanisms to be runned healthy. If the production of free radicals is excessive and molecules that liable for defensiveness are not exist or not sufficient then this circumstance causes destruction in living cells. Free radicals consist of both the interbody and in-vitro factors. Besides interbody sourced instances as aerobic respiration, metabolism and infection free radicals also consist of under the influence of external environmental factors as tobacco, alcohol, x-rays, sunlight and pollution. In addition to smoking and alcohol these molecules also occurs in the body due to stress. Produced by either through eatables or metabolic reactions people are always faced with these degenerative molecules. Free radicals anywhere in the body can gives up or get electrons. Thus, cells, proteins and DNA can be damaged. As well as free radicals may cause cancer by binding and so triggering on the occurrence of harmful changes in DNA molecules they may also cause diabetes concentrating in the pancreas, cataract, heart and circulatory system diseases. Measures to be taken can minimize the deleterious effects or avoid it. Antioxidants prevents damaging the cells by reacting with free radicals (by linking to them). With these features, by the reason of reducing the risk of forming abnormal cells and thus tumor formation as well as reducing cell destruction they increase the chance of a healthy life with minimum aging effects. Antioxidants become oxidized while preventing the oxidation process by deactivating the free radicals. Therefore, our body has a continuous need for antioxidants. There are many different substances whose antioxidant properties have discovered. Whereas getting a portion of these substances in our diet (especially from plants) a part of them is produced by the body itself as a defence system against free radicals. Antioxidants, produced in defense of the body against free radicals are the enzymes such as catalase, glutathione peroxidase and SOD (superoxide dismutase). In this study, determination of the antioxidant capacity of the fruits Hackberry and Laurel is aimed. Studies on the antioxidant capacity of Hackberry fruit is limited.. Earlier studies are mostly related to effects of hackberry leaves on air quality and the use of hackberry bark and leaves as biomonitor on determination of heavy metal concentrations in the air. Scarce studies on the antioxidant capacity of hackberry fruit and the case that hackberry species are widespread in the geography of our country have been influential to actualize this study. Antioxidant determination methods by being applied to green, yellow and black cases of hackberry fruit during the ripening stage, it is aimed to determine the change of the antioxidant capacity of hackberry along the growing process and the causes of the current changes. Furthermore, antioxidant capacity of the Laurel fruit was also analyzed. By collecting Laurel samples from Araklı county of Trabzon and Istanbul Technical University at the same time, capacities of the same species grown in different regions were compared. There have been earlier studies regarding the antioxidant capacity of Laurel fruit yet with different antioxidant assay methods used in this study Laurel antioxidant capacity results have been supported. In our study, antioxidant capacity measurement methods of CUPRAC, CERAC, Folin-Ciocalteu and SDS modified ferricyanide are used. In order to apply these methods, Hackberry fruit extracts and infusion and the Laurel fruit extracts were primarily prepared. While CUPRAC method was being applied to extracts, by adding pure water and reactive solutions of 1 mL 1,0 × 10-2 M CuCl2, 1 mL 7,5 × 10-3M neocuproin and 1 mL NH4Ac to 4.1 ml in total, it is waited for 30 minutes for the reaction to take place. Absorbance measurements were taken at 450 nm wavelength which Cu(I) chelate of neocuproin showed maximum absorbance and repeated 3 times. In analyzes carried out by CERAC method, taken varying amounts of a solution of 1×10-3 M trolox, 1mL 2 x 10-3 M Ce(IV) solution, 7 mL 1 M Na2SO4 solution, by adding pure water and sample extracts to 10 ml total volume, it is waited for 30 minutes for the reaction to take place. Absorbance measurements were taken at 320 nm wavelength which Ce(IV) showed maximum absorbance and repeated 3 times. In analyzes carried out by Folin-Ciocalteu method, adding x mL sample solution + (2-x) mL water + 2,5 mL Lowry C and after waiting for 10 minutes, and then adding over 1:3 diluted 0,25 mL Folin reactive it is left for 30 minutes at room temperature. As with other methods, the measurements were repeated 3 times. As to SDS modified Ferricyanide method, x mL antioxidant + (1-x) mL absolute EtOH + 6,3 mL H2O + 0,2 mL 1 M HCl + 1,5 mL 1% (w/v) K3Fe(CN)6 + 0,5 mL 1% (w/v) SDS + 0,5 mL 0,2 % (w/v) FeCl3.6H2O mixed to 10 ml total volume and thereafter keeping waited 30 minutes absorbances were measured at 750 nm (A750) against blank absorbance. Measurements were repeated 3 times. Hackberry fruit samples were collected from İTÜ Ayazağa Campus in order to prepare hackberry extracts. Kernel and fruit parts of hackberry was seperated and triturated in a mortar. As the solvent 80 % (v / v) methanol is used and it is extracted by shaking at 350 rpm in the shaker (hackberry's kernel and fruits parts seperately for 2 hours at total). All subsequent hackberry fruit extraction and infusion operations were conducted under these conditions ((a total of 2 hours and 350 rpm). According to the results obtained using CUPRAC method, in the kernel part of hackberry, much lower antioxidant capacity than the fruit part of hackberry was observed and further studies were proceeded with the fruit fraction of hackberry. Appropriate type of solvent were tried to determine for the extraction of hackberry and for this purpose ethanol, methanol and acetone were selected as extraction solvents. Before preparing extracts, hackberry fruit was seperated from its kernel part and allowed to dry at room temperature for 3 days, after then drying the sample was prepared by trituration. CUPRAC method was conducted to prepared hackberry extracts using ethanol, methanol and acetone solvents. The results according to antioxidant capacity are as follows: 70 % (v / v) acetone > 80 % (v / v) methanol > 80 % (v / v) ethanol > ansolute methanol > absolute ethanol. It was decided to use methanol as the solvent instead of acetone in consequence of not to be encountered with any restriction or problem for use in different studies to be performed later. In solvent optimization studies, hackberry extracts were prepared using absolute, 80 %, 70 %, 50 %, 40 % and 25 % (v / v) methanols and applying CUPRAC method to these extracts it was found that the extracts prepared with 50 % (v / v) with methanol had the highest antioxidant capacity with the value of 0,072 (mmol TR/g). Extracts with 50 % (v / v) methanol were prepared for the green, yellow and black cases of hackberry fruit which turns into during the ripening stage nevertheless green, yellow and black hackberry fruit infusions were also prepared. Modified Ferricyanide methods by CUPRAC, CERAC, Folin-Ciocalteu and SDS are applied to 50 % (v / v) methanol extracts and infusions and, as the results of each method, antioxidant capacity amounts were determined in that: green > yellow > black as mmol TR/g.. Besides, antioxidant capacity amounts for all 4 methods were seen that 50 % hackberry methanol extract > hackberry infusion as mmol TR/g. Laurel fruits collecting from İstanbul Technical University Ayazağa Campus (İST KRY) and the Araklı county of Trabzon (TR KRY) were used on determination of the antioxidant capacity of Laurel fruit. Laurel fruits of İST KRY and TR KRY were peeled from their kernels seperately, passed through blender and kernels were pulverized in a mortar. As the solvent, 80 % (v / v) methyl alcohol was used and fruit and kernel parts of Laurel fruit were seperately extracted with 350 rpm agitation for 2 hours in shaker. According to the results obtained using CUPRAC method, much lower activity was observed on the kernel part of Laurel as compared with fruit part and further studies were contucted with the fruit fraction. Examination of the effect of different drying methods on antioxidant capacity of Laurel fruit is aimed and TR KRY fruits were used as the sample. TR KRY is seperated from its kernels, fruit part is homogenized with shredder and each containing 2 g of sample 3 separate series are composed. 3 samples were placed in a lyophilizer for lyophilization (LİYO), 3 samples were extracted adding over solvent while they are wet (YAŞ), 3 samples were spreaded onto watch glass to dry in the daylight. (T