Activadores del desarrollo patológico de la cardiopatía arritmogénica de ventrículo derecho (ARVC)

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 15-09-2017Multitud de recientes avances médicos se sustentan en logros en ciencia básica que se han trasladado a la clínica gracias a diversos modelos animales de experimentación. Los avances en medicina requieren del uso de buenos modelos animales para trasladar la investigación básica a la clínica. El problema surge cuando estos modelos no están disponibles, bien porque no recapitulan a nivel fisiológico todos los aspectos de la patología humana o bien porque los modelos animales no existen, como ocurre con algunas cardiomiopatías hereditarias. Tal es el caso de la cardiomiopatía arritmogénica de ventrículo derecho (ARVC), un claro ejemplo de enfermedad cardiaca con base genética con más de 380 mutaciones asociadas, y con un número limitado de modelos transgénicos capaces de distinguir mutaciones patológicas de simples variaciones genéticas normales. En este trabajo utilizamos virus adeno-asociados (AAV), una herramienta ampliamente utilizada en terapia génica, para desarrollar, en contraste, un modelo patológico murino capaz de mimetizar un desorden genético humano. Evaluamos la contribución patológica de la versión mutante R735X de Pkp2 en el desarrollo de eventos ARVC, mediante una simple y rápida inyección intravenosa de partículas AAV. En comparación con los sistemas tradicionales de generación de modelos animales transgénicos, este método resulta mucho más versátil, barato, y simple, además de reducir el tiempo experimental y el uso de animales. Debido a que el desarrollo de la enfermedad parece acelerarse en jóvenes atletas, y a que no se ha demostrado formalmente la asociación entre ejercicio y la patología, los ratones fueron sometidos a un protocolo de natación severa para demostrar que la expresión cardiaca de la proteína mutante R791X de Pkp2 desarrolla disfunción del ventrículo derecho. Además, demostramos una clara predisposición a sufrir eventos ARVC en portadores de la mutación durante el tratamiento con doxorrubicina, un potente fármaco antineoplásico con fuertes efectos cardiotóxicos, En resumen, desarrollamos un nuevo método con el potencial de dar soporte a otros campos de investigación, reforzando además el principio de las 3Rs a favor al uso racional de animales de experimentación. Establecemos y validamos una cardiomiopatía con herencia autosómica dominante, mediante inyección de partículas AAV en animales silvestres, y sin necesidad de generar una colonia transgénica. Demostramos que tanto ejercicio como la exposición a cardiotóxicos son potentes inductores de la enfermedad en portadores de la mutación R735X de Pkp2, corroborando que nuestro modelo cumple con las principales pautas para el diagnóstico de ARVC en humanos, y validando el modelo para futuros estudios.To improve human health, discoveries in basic research requires preclinical testing using adequate animal models to translate them into clinics. These disease-models are not always available, like is the case for some genetic-based cardiomyopathies. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia (ARVC), one of the most important causes of sudden cardiac death in young population, is a good example of a complex cardiac disease with a long list of described deleterious mutations. Even though more than 380 mutations have been described a limited number of transgenic disease models expressing mutant alleles are available to evaluate their pathological contribution. In this work, we adapt well-accepted gene therapy tools, adeno-associated virus (AAV), initially designed for genetic diseases treatment and correction, to generate in contrast a disease mouse model that mimic a human cardiac genetic disorder. We define both an approach and contribution to ARVC of cardiac-specific trans-expressed Pkp2 dominant-negative mutant compared to wild type mice heart using a single systemic injection of AAV particles. This method when compared with generation of multiple transgenic mouse lines in the study of inherited autosomal dominant cardiomyopathies is more versatile, cost-effective, simpler, and reduces the experimental time frame. Since ARVC disease penetrance is accelerated in young athletes we have included in our experimental settings an endurance swimming training protocol to demonstrate that cardiac AAVmediated transexpression of Pkp2 disease-causing mutant develops right ventricle dysfunction. In addition, we evaluated the predisposition to suffer ARVC events during doxorubicin treatment, a potent anticancer drug with cardiotoxic effects described. We corroborate that our transgenic-like model fulfill major task force criteria for ARVC diagnosis in humans. In summary, our work has the potential to add value to other research fields and the general public, such as disease-modeling, cardiology and transgenesis, reinforcing the 3Rs principle in favor of the rational use of animal in experimentation. This study offers an example of a new rationale to refocus specific gene therapy tools into an established and well validated autosomal dominant dependent cardiopathology. We demostrate that both exercise and doxorrubicin therapy are potent inducer of the disease in R735X carrier mutation, validating the model for future study, prevention or treatment