Genetic and proteomic study of ERCC4/XPF in DNA repair and human diseases

Qualsevol canvi en el DNA d’un organisme pot afectar tots els aspectes de la seva vida, fins el punt de comprometre-la. Per tal de superar aquesta situació, les cèl·lules han evolucionat fins adquirir sofisticades maquinàries de reparació del dany causat al DNA. Degut a això, el nostre DNA conté la informació necessària per tal de produir proteïnes que participen en el reconeixement al dany, la unió, l’excisió i el restabliment de la informació correcta a les heures de DNA. Una d’aquestes proteïnes és l’endonucleasa XPF, la qual constitueix la subunitat catalítica de l’heterodímer estable XPF-ERCC1, capacitada per dur a terme una incisió a l’extrem 5’ de diferents danys al DNA. Aquesta proteïna essencial està codificada pel gen ERCC4 i participa en múltiples rutes de manteniment del genoma incloent-hi la ruta de reparació per excisió de nucleòtids (NER), la ruta de reparació dels enllaços entrecreuants (ICL), en diverses subrutes de reparació dels trencaments de doble cadena (DSB) com la unió d’extrems mitjançant microhomologies (MMEJ) i la hibridació de cadena simple (SSA), i se li han atorgat possibles funcions de suport en la reparació del dany oxidatiu i en el manteniment de telòmers a més de participar en la resposta de la quimioteràpia al càncer. Si es tenen en compte le seves implicacions en la reparació del DNA, no sorprèn que mutacions en XPF estiguen associades amb un ampli rang de malalties humanes incloent-hi la Xeroderma Pigmentosum (XP), la Progèria Segmental (XFE), la Síndrome de Cockayne (CS) i diversos casos que combinen la Xeroderma i la síndrome de Cockayne (XPCSCD). Una millor comprensió de (i) la correlació entre les mutacions patogèniques i els fenotips dels pacients i (ii) els mecanismes essencials de reparació del DNA proporcionarà un avenç en el desenvolupament dels possibles tractaments. En aquest treball es presenta un resum detallat dels estudis funcionals duts a terme amb un conjunt de cèl·lules que contenien mutacions patogèniques en XPF sobre un fons genèticament homogeni. Els mutants de XPF seleccionats, ubicats en diferents dominis de la proteïna, i les síndromes humanes associades van ser les següents: XPFR153P (XFE), XPFI225M (XP), XPFL230P (FA), XPFC236R (CS), XPFR589W (XP/XPCSCD), XPFR689S (FA), XPFR799W (XP/XFE-CS). Els estudis funcionals detallats inclouen els anàlisis de la ruta NER (sensibilitat a UVC, UDS i RRS) i la ruta ICLR (sensibilitat a ICL, aturada en G2/M induïda per ICL i fragilitat cromosòmica induïda per ICL). Els nostres resultats emfasitzen en la importància d’altres factors, més enllà de la posició de la variant en la proteïna, per tal d’associar qualsevol mutant de XPF a un fenotip clínic determinat. En aquest marc, i amb el propòsit d’incrementar el nostre coneixement sobre les interaccions de XPF que poden regular la seva funció en les diferents rutes de reparació del DNA, vam investigar l’interactoma de XPF. La implementació de les tècniques proteòmiques més avançades incloent la purificació en tàndem per afinitat, co-immunoprecipitacions i SILAC, acoblada a l’espectrometria de masses ens va conduir a la identificació d’un nou interactor de XPF involucrat en el manteniment del genoma: USP11, una deubiquitinasa coneguda per regular l’activitat de proteïnes relacionades funcionalment com BRCA2 o XPC. Aquí nosaltres demostrem que la interacció de XPF-USP11 és independent del DNA i ocorre independentment del dany d’aquest. Així mateix, demostrem que USP11 regula la reparació dels DSB per SSA i possiblement la NER però no està involucrada en HR o ICLR.A change in an organism’s DNA can affect all the aspects of its life, until the point of compromising it. To overcome this, cells have evolved sophisticated machineries of DNA damage repair. Thus, our DNA contains the necessary information to produce proteins that participate in damage recognition, binding, excision and in the reestablishment of correct genetic information. One of these proteins is the XPF endonuclease, which is the catalytic subunit of the stable heterodimer XPF-ERCC1, able to incise at the 5’ side at different DNA damages. This essential protein is encoded by ERCC4 gene and participates in multiple genome maintenance pathways including nucleotide excision repair (NER), interstrand crosslink (ICL) repair, double strand break (DSB) repair pathways such as microhomology-mediated end joining (MMEJ) and single strand annealing (SSA). XPF has also been suggested to have possible backup roles in repairing oxidative damage and in telomere maintenance besides to have a role in the response of cancer cells to chemotherapy. Considering its wide involvement in multiple DNA repair pathways, it is not surprising that ERCC4 mutations are associated to a range of human diseases including Xeroderma Pigmentosum (XP), Segmental Progeria (XFE), Fanconi Anemia (FA), Cockayne Syndrome (CS) and several cases combined diseases of Xeroderma and Cockayne syndromes (XPCSCD). A better understanding of (i) the correlation between the pathogenic mutations and patients’ phenotype and (ii) the essential DNA repair mechanisms is expected to promote a faster development of possible treatments. Here we report a detailed overview of functional studies performed with a set of cells containing pathogenic XPF mutations in a genetically homogeneous background. The selected XPF mutants, located in different domains of the protein, and the resulting human syndromes, were the following: XPFR153P (XFE), XPFI225M (XP), XPFL230P (FA), XPFC236R (CS), XPFR589W (XP/XPCSCD), XPFR689S (FA), XPFR799W (XP/XFE-CS). Detailed functional studies include the analyses of NER pathway (UVC sensitivity, UDS and RRS) and ICLR pathway (ICL sensitivity, ICL-induced G2/M arrest and ICL-induced chromosome fragility). Our results emphasize the importance of other factors, beyond protein position of the variant, such as protein levels, cell localization and the molecular interactions, in order to associate any XPF mutant to a clinical phenotype. In this framework, and to increase our knowledge about XPF interactions that can regulate XPF functions in the distinct DNA repair pathways, we investigated the XPF interactome. The implementation of the most advanced proteomic technics including tandem affinity purification, co-immunoprecipitation and SILAC, coupled to mass spectrometry led us to identify a new XPF interactor involved in genome maintenance: USP11, a deubiquitinase that is known to regulate the activity of functionally related proteins such as BRCA2 or XPC. Here we prove XPF-USP11 interaction occurs irrespective of DNA damage and is DNA–independent. We also demonstrate that USP11 regulates DSB repair by SSA and possibly NER but is not involved in HR or ICLR