Caracterización de polifenoles y su acción sobre sirtuínas en modelos de inflamación intestinal y cáncer

Tesis descargada de TESEOEl estudio de los productos procedentes de la naturaleza, ya sean de plantas, animales invertebrados, o microorganismos, continúa siendo en la actualidad uno de los procedimientos más consistentes para el descubrimiento de nuevos compuestos que puedan dar lugar al desarrollo de fármacos. En este sentido, es interesante señalar que aproximadamente la mitad de los nuevos medicamentos introducidos entre 1981 y 2006 son derivados de productos naturales. De entre todos ellos, los polifenoles son uno de los grupos más estudiados; no obstante, las investigaciones con nuevas especies vegetales, los ensayos con extractos polifenólicos, así como la búsqueda de derivados con interés farmacológico está en claro desarrollo. Se tratan de metabolitos secundarios de plantas involucrados generalmente en los mecanismos de defensa frente agresiones externas. Con más de 8.000 variantes estructurales, la base estructural común es la presencia de uno o varios anillos fenólicos. La actividad antiradicales libres de los polifenoles está ampliamente descrita, constituyendo los antioxidantes más potentes presentes en nuestra dieta. Sin embargo se siguen investigando nuevas propiedades y en este sentido destaca la actividad antiinflamatoria. La inflamación es una reacción de la microcirculación que se caracteriza por la migración de las proteínas del suero y los leucocitos de la sangre al tejido extravascular. Esta migración se regula por la liberación secuencial de mediadores vasoactivos y quimiotácticos, tales como histamina, 5-OH-triptamina, moléculas de adhesión, y citocinas tales como el factor de necrosis tumoral-¿ (TNF-¿), o las interleucinas 1, 6, 8 y 10. Estos procesos se acompañan de un aumento de la temperatura local, enrojecimiento, hinchazón, dolor, y pérdida de la función del tejido, y a nivel celular los mecanismos de regulación son complejos involucrando a diversas vías de señalización. Son de gran interés las evidencias sobre las múltiples asociaciones entre las enfermedades inflamatorias crónicas y diferentes tipos de neoplasias; entre ellas están las que implican a la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y evolución hacia el cáncer de colon. La EII es un término utilizado para definir a un grupo de trastornos inflamatorios intestinales crónicos, afectando principalmente al intestino grueso, de etiología desconocida. Dentro de este grupo de trastornos están incluidas la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Ambas patologías se caracterizan por la aparición de una inflamación aguda recurrente de segmentos del intestino delgado y/o colon, con manifestaciones clínicas tanto intestinales como extraintestinales, que con frecuencia presentan recidivas. Las sirtuínas son histonas desacetilasas tipo III, ampliamente distribuidas en la naturaleza, con demostradas implicaciones en procesos como la inflamación, la senescencia celular, la diferenciación celular o el metabolismo. Su mecanismo de regulación se debe a su capacidad de desacetilar tanto histonas como proteínas no histonas. Existen numerosos estudios que muestran cómo el aumento de polifenoles en la dieta protege frente a enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares, inflamatorias y metabólicas, y se está discutiendo su papel en algunos procesos cancerosos, siempre consecuencia de la actividad desacetilasa de las sirtuínas. El resveratrol fue el primer compuesto polifenólico que demostró activar la sirtuína 1 (SIRT1), y ya se han descrito derivados que son hasta 800 veces más eficaces. La modulación de sirtuínas a través de otros reguladores, como la proteín cinasa activada por AMP (AMPK), es un campo de gran debate y estudio; además se está analizando la participación de ambas proteínas en la regulación del proceso de autofagia. En las investigaciones relacionadas con nuestro proyecto de tesis se ha estudiado la actividad biológica de algunos compuestos polifenólicos y su relación con las sirtuínas. Se han ensayado tanto compuestos puros (resveratrol y quercetina) como extractos enriquecidos en polifenoles (hojas de mango, hojas de uva), realizando estudios in vitro e in vivo. Concretamente: - Hemos valorado la actividad citotóxica en dos líneas celulares, la línea de leucemia monocitaria aguda humana (THP-1) y otra de adenocarcinoma de colon humano (HT-29). Si bien ninguno de los compuestos mostró actividad citotóxica con las diferentes dosis ensayadas, sí mostraron una reducción significativa en la producción de TNF-¿ en macrófagos THP-1 estimulados con lipopolisacárido bacteriano. Además, la expresión de SIRT1 se vio incrementada de manera significativa tras la exposición a los compuestos polifenólicos. - El primer estudio in vivo se han realizado con ratones deficientes en interleucina 10 (IL-10). Estos ratones knockouts se caracterizan por desarrollar de manera espontánea colitis inflamatoria que, a medida que la enfermedad avanza, puede derivar en cáncer de colon. La evaluación del proceso se ha realizado examinando y sacrificando ordenadamente los ratones a distintas edades, entre las 6 y las 18 semanas. Los resultados confirmaron que los animales deficientes en IL-10 desarrollaron una colitis inflamatoria a partir de la 6ª semana, cuya gravedad aumentó progresivamente a medida que la edad de los mismos avanzaba. En este sentido, los animales presentaron lesiones displásicas a partir de las 10 semanas, hallándose cierta correlación entre la gravedad de las lesiones yel proceso inflamatorio previo (escala). Además, se analizó la expresión colónica de SIRT1, presentando una marcada reducción en todos los grupos de animales KO para IL-10. Los resultados de este estudio también mostraron una activación de la autofagia en todos los grupos de ratones deficientes en IL-10, evidenciada por la acumulación de la proteína LC3-II, el incremento en la expresión de Beclin 1 y la disminución de los niveles de Bcl-2. - El segundo estudio in vivo consistió en evaluar el efecto de un extracto de hojas de mango, conteniendo un 60% de manguiferina, en un modelo agudo de colitis ulcerosa por administración de dextranosulfato sódico al 3% en el agua de bebida durante 7 días. Se emplearon distintos grupos entre los que se encontraba uno que recibió un tratamiento con resveratrol (50 mg/kg), como polifenol de referencia, y otros dos grupos de animales que recibieron el extracto de mango, a las dosis de 50 y 100 mg/kg. Los resultados mostraron que tanto el resveratrol como el extracto de hoja de mango podrían aliviar efectivamente la colitis, con incremento notable en la producción de moco, e inhibición de la infiltración neutrofílica y de mediadores inflamatorios incluyendo las citocinas TNF-¿ e IL-6, y la enzima COX-2. Además, los ratones tratados con resveratrol o el extracto de hoja de mango experimentaron un marcado incremento en la expresión de SIRT1 y pAMPK. Estos hallazgos sugieren que un papel destacado de los compuestos polifenólicos como estrategia terapéutica para el tratamiento de la fase activa de la colitis. - Con el fin de profundizar en el estudio de los efectos de los polifenoles como reguladores de sirtuínas, se realizaron nuevos ensayos con el nematodo Caenorhabditis elegans. Este organismo es un modelo muy empleado desde los años 70, sobre todo en estudios genéticos. El conocimiento actual de su genoma permite la elaboración de mutantes a la carta. Aunque en farmacología no es un modelo muy extendido, nos propusimos su empleo para detectar, además de los efectos sobre las sirtuínas, otras actividades que pudieran estar relacionadas. Uno de los mutantes utilizados para estos ensayos fue el mutante para el gen ire-1 (inositol requiring enzyme 1) que presentaba un mayor acúmulo de triglicéridos. La administración de metformina (100 mM), fármaco activador de AMPK, consiguió reducir la cantidad de triglicéridos acumulados en el interior del gusano, tanto en el mutante obeso como en los gusanos wild type (N2). Con el objeto de estudiar los posibles mecanismos por los cuales la metformina es capaz de revertir el ¿fenotipo obeso¿, se determinó la expresión de las lipasas FIL-1 y FIL-2 (del inglés fasting-induced lipase), activadas por ire1, así como los niveles de sir2.1, que es la sirtuína principal en C. elegans. Nuestros hallazgos sugieren que la metformina reduce la acumulación de triglicéridos a través del aumento en la expresión de las lipasas FIL-1 y FIL-2 en el fenotipo obeso, así como el incremento en los niveles de sir2.1 tanto en los gusanos wild type como en los mutantes obesos. El siguiente paso fue ensayar el efecto del resveratrol en la acumulación de triglicéridos en la cepa silvestre y en un mutante que no expresaba sirtuínas, el mutante sir2.1. El tratamiento de los gusanos con resveratrol (100 µM) mimetizó los efectos de la metformina, consiguiendo reducir el contenido de triglicéridos en los gusanos N2. Sin embargo, estos efectos desaparecieron al emplear el mutante sir2.1, ya que tras la administración del resveratrol o la metformina se pudo comprobar que este gusano no adelgazaba. Al igual que la metformina, el resveratrol no consiguió incrementar los niveles de las lipasas FIL-1 y FIL-2 en ninguna de las dos cepas. Estos resultados sugieren que el efecto adelgazante del resveratrol, al igual que la metformina, es dependiente de sirtuínas. Finalmente, se evaluó el efecto del extracto de hojas de mango sobre la longevidad del nematodo, en base a los estudios previos que demostraban que el resveratrol incrementaba este parámetro. En este sentido, los datos actuales sobre el incremento de longevidad mediante activadores de sirtuínas son muy discutidos. Nuestros resultados mostraron que el extracto de hojas de mango, a las concentraciones de 50 y 200 µg/mL no conseguía aumentar significativamente los días de vida del nematodo, aunque sí lograba que los gusanos tuvieran una vida media ligeramente mayor. La ¿teoría del soma¿ propone que el incremento de longevidad puede conseguirse, entre otros, por la reducción del tamaño, o por la restricción calórica. El tratamiento con el extracto de hoja de mango produjo cambios significativos en la longitud de los gusanos y en la ingesta de alimento (parámetro que está directamente relacionado con la restricción calórica) en la cepa N2 pero no así en la cepa sir2.1, por lo que el aumento de longevidad de los gusanos que recibieron el extracto parece dependiente de sirtuínas. Aun así se necesitan más estudios que relacionen de forma directa la estimulación de sirtuínas con el incremento de longevidad. En conclusión, tanto los estudios in vitro como los realizados in vivo demuestran los efectos beneficiosos de los polifenoles en inflamación con mecanismos que implican a la enzima SIRT1 como elemento clave de regulación de diferentes vías relacionadas