Development and improvement of strategies for the in vitro conservation and propagation of Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen and Lippia filifolia (Mart. And Schauer ex Schauer), with emphasis on the use of mineral oil and temporary immersion bioreactors

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, 2017.Pfaffia glomerata e Lippia filifolia apresentam importantes propriedades medicinais e fazem parte da lista de espécies que podem ser distribuídas aos usuários do Sistema Único de Saúde (SUS). Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e aperfeiçoar estratégias para a conservação e propagação in vitro de Pfaffia glomerata e Lippia filifolia, com ênfase ao uso do óleo mineral e o uso de biorreatores de imersão temporária. Para os estudos de micropropagação utilizou-se como material vegetal microestacas (1,0 cm) contendo uma gema lateral, as quais foram inoculadas em diferentes sistemas de cultivo: meio semissólido, líquido estacionário, líquido sob agitação e líquido em biorreatores de imersão temporária, modelos RITA® e BIT Embrapa®. Após 30 dias de cultivo, a percentagem de sobrevivência, a altura, a taxa de multiplicação e a taxa de enraizamento das brotações, além do peso da massa fresca (g) e seca (g) dos brotos regenerados nos cinco sistemas de cultivo foram avaliados. Já para a conservação in vitro dois experimentos foram realizados. No primeiro deles, microestacas de aproximadamente 1,0 cm de altura com pelo menos uma gema lateral foram avaliadas as quais foram inoculadas em meio de MS e mantidas, inicialmente sob uma camada de óleo mineral contendo diferentes volumes (5, 10 e 15 mL) sobre as estacas e colocadas sobre diferentes temperaturas (15, 20 e 25°C). A caracterização anatômica foi realizada com o auxilio do corante Azul de Toluidina e para as análises histoquímicas foram utilizados o Reagente de Schiff/ ácido periódico - PAS para polissacarídeos neutros e o Xylidine Ponceau para proteínas totais. Nos resultados referentes a micropropagação, verificou-se que P. glomerata apresentou altas taxas de multiplicação nos sistemas de cultivo líquido com agitação e líquido em biorreatores de imersão temporária modelo RITA®, e semissólido. O cultivo em biorreatores de imersão temporária modelo RITA® proporcionou melhores resultados para ganho de massa fresca e seca, altura e taxa de enraizamento. Para a multiplicação de L. filifolia o sistema de cultivo semissólido proporcionou uma alta taxa de sobrevivência e formação de plantas com altura média de 7,0 cm. Variações morfológicas foram verificadas nas plantas cultivadas no sistema de cultivo líquido com e sem agitação. O sistema de biorreatores de imersão temporária modelo RITA® apresentou resultados superiores quando comparados ao modelo Embrapa. De maneira geral, a L. filifolia apresentou dificuldades de enraizamento in vitro. O resultado do primeiro experimento de conservação mostrou que as duas espécies estudadas apresentaram médias de sobrevivência em óleo mineral acima de 90 %, sugerindo ser uma alternativa para a conservação das espécies. No experimento de conservação, verificou-se que P. glomerata pode ser mantida por até 12 meses sob temperatura de 15 °C e imersa sob óleo mineral, com sobrevivência média acima de 90%. A L. filifolia obteve uma menor taxa de sobrevivência com média de 24,9% na temperatura de 15 °C, após os 12 meses de conservação. Anatomicamente as folhas de P. glomerata no tratamento de 5 mL apresentaram folhas mais espessas, com células do parênquima do tipo paliçádico, as células do mesofilo apresentaram arranjo compacto com poucos espaços intercelulares. No tratamento com 15 mL de óleo mineral, as células da epiderme e do mesofilo foram mais volumosas com paredes celulares delgadas. O caule das plantas que estavam conservadas em óleo mineral, independente do tratamento, não apresentou fistula. Para a L. filifolia no tratamento com 5mL de óleo mineral as folhas se apresentaram delgadas com epiderme contendo células volumosas, arredondadas e achatadas. O mesofilo apresentou parênquima clorofiliano com células paliçádicas, com células arredondadas e achatadas com espaços intercelulares. Foi verificado a presença de tricomas em ambas as faces epidérmicas. No tratamento com 10 mL de óleo mineral, foi possível observar um desarranjo das células que compõe o cilindro vascular, com células adjacentes aos feixes vasculares. As plantas conservadas em 15 mL de óleo mineral apresentaram epiderme espessa e mesofilo com células volumosas e compactas com vários espaços intercelulares. No caule, os tratamentos com óleo mineral apresentaram células de maior volume quando comparados com o controle. No tratamento com 5 mL, as células do cortex apresentaram formato alongado e vários espaços intercelulares. Os feixes vasculares são menores. Histoquimicamente evidenciou-se que o amido e as proteínas aparecem como material de reserva na folha e no caule das duas espécies.Pfaffia glomerata and Lippia filifolia have important medicinal properties and are part of the list of species that can be distributed to users of the Unified Health System (SUS). In this sense, the objective of the present work was to develop and improve strategies for the in vitro conservation and propagation of Pfaffia glomerata and Lippia filifolia, with emphasis on the use of mineral oil and the use of temporary immersion bioreactors. For the micropropagation studies, microcuttings (1.0 cm) containing a lateral yolk were used as plant material, which were inoculated in different culture systems: semisolid medium, stationary liquid, liquid under stirring and liquid in temporary immersion bioreactors, RITA® and BIT Embrapa® models. After 30 days of cultivation, the percentage of survival, height, multiplication rate and shoot rooting rate, as well as the weight of the fresh (g) and dry mass (g) of the regenerated shoots in the five cropping systems were evaluated . For the in vitro conservation, two experiments were performed. In the first one, microseconds of approximately 1.0 cm in height with at least one lateral yolk were evaluated which were inoculated in MS medium and initially maintained under a layer of mineral oil containing different volumes (5, 10 and 15 mL) On the cuttings and placed at different temperatures (15, 20 and 25 ° C). The anatomical characterization was performed with the aid of the Toluidine Blue dye and for the histochemical analyzes the Schiff Reagent / periodic acid - PAS was used for neutral polysaccharides and Xylidine Ponceau for total proteins. In the micropropagation results, it was verified that P. glomerata showed high multiplication rates in the liquid culture systems with agitation and liquid in temporary immersion bioreactors RITA model, and semi-solid. The cultivation in RITA® temporary immersion bioreactors provided better results for fresh and dry mass gain, height and rooting rate. For the multiplication of L. filifolia the semi-solid cultivation system provided a high survival rate and formation of plants with a mean height of 7.0 cm. Morphological variations were verified in plants cultivated in the liquid culture system with and without agitation. The RITA® temporary immersion bioreactor system presented superior results when compared to the Embrapa model. In general, L. filifolia presented difficulties in in vitro rooting. The results of the first conservation experiment showed that the two species studied presented survival averages in mineral oil above 90%, suggesting that it is an alternative for the conservation of the species. In the conservation experiment, it was found that P. glomerata can be maintained for up to 12 months at a temperature of 15 ° C and immersed under mineral oil, with a mean survival above 90%. L. filifolia had a lower survival rate with a mean of 24.9% at 15 ° C after 12 months of storage. Anatomically the leaves of P. glomerata in the treatment of 5 mL presented thicker leaves, with cells of the parenchyma of the paliçádico type, the cells of the mesofilo presented compact arrangement with few intercellular spaces. In the treatment with 15 ml of mineral oil, the cells of the epidermis and the mesophyll were more voluminous with thin cell walls. The stem of the plants that were conserved in mineral oil, regardless of the treatment, did not present fistula. For L. filifolia in the treatment with 5mL of mineral oil the leaves were thin with epidermis containing bulky, rounded and flattened cells. The mesophyll presented chlorophyllic parenchyma with paliçadic cells, with rounded and flattened cells with intercellular spaces. The presence of trichomes on both epidermal faces was verified. In the treatment with 10 mL of mineral oil, it was possible to observe a derangement of the cells that make up the vascular cylinder, with cells adjacent to the vascular bundles. The plants preserved in 15 mL of mineral oil presented thick and mesophilic epidermis with voluminous and compact cells with several intercellular spaces. In the stem, the treatments with mineral oil presented cells of greater volume when compared with the control. In the 5 mL treatment, the cortex cells presented an elongated shape and several intercellular spaces. The vascular bundles are smaller. Histochemically showed that the starch and the proteins appear as reserve material in the leaf and stem of the two species