Increasing Saccharomyces cerevisiae tolerance to stressing factors of ethanolic fermentation: modified strains and amino acid supplementation

O aumento da participação dos biocombustíveis na matriz energética mundial pode ajudar a prolongar a existência das reservas de petróleo, mitigar as ameaças representadas pela mudança climática e permitir melhor segurança do fornecimento de energia em uma escala global. Neste cenário, o processo brasileiro da produção de etanol a partir da cana-de-açúcar tem ganhado papel de destaque, pelo alto rendimento e baixo custo da produção. Linhagens de S. cerevisiae são amplamente empregadas nas fermentações industriais e, embora sejam consideradas mais tolerantes em relação a outras, o processo brasileiro impõe uma variedade de fatores estressantes sob a mesma, afetando o seu metabolismo e crescimento. A fermentação com alto teor alcoólico, realizada a partir da utilização de mostos contendo altas concentrações de açúcares, é uma das maneiras mais eficientes de se obter elevados níveis de etanol. No entanto, tal tecnologia procede ocasionando efeitos deletérios adicionais à levedura. Neste contexto, aumentar a tolerância da levedura é de fundamental importância para alcançar um desempenho fermentativo satisfatório. Neste estudo foram avaliadas linhagens de S. cerevisiae, isogênicas a linhagem industrial CAT-1, com a sobre-expressão dos genes TRP1 e MSN2, envolvidos na biossíntese de triptofano e na resposta geral ao estresse, respectivamente. Tais linhagens foram avaliadas quanto ao seu potencial para realizar fermentações com alto teor alcoólico, simulando as condições industriais brasileiras. Os resultados revelaram que o gene MSN2, na versão truncada, favoreceu a linhagem principalmente com relação ao estresse osmótico, aumentando a velocidade de fermentação e o consumo de açúcares. O gene TRP1 promoveu maior crescimento da linhagem em meio YEPD com 8% de etanol, contudo, tornou a linhagem menos viável em concentrações acima deste nível. No presente trabalho também foi avaliado o efeito da suplementação de aminoácidos na fisiologia da linhagem CAT-1 em meio YNB e em mostos de melaço e xarope de cana-de-açúcar. A suplementação com histidida promoveu maior crescimento e viabilidade celular nos diferentes meios testados. Além de histidina, os aminoácidos lisina e alanina aumentaram o crescimento da CAT-1 em mosto de melaço. A suplementação de triptofano e asparagina também promoveu aumento da viabilidade celular em mosto de xarope. Por outro lado, nos testes em microplacas a suplementação com cisteína depreciou o crescimento da linhagem em meio YNB com 10 e 12% de etanol e em mosto de melaço com 20% de ART. Os resultados obtidos indicam que tanto a engenharia genética, quanto a suplementação de aminoácidos podem ser alternativas viáveis para aumentar a tolerância de S. cerevisiae, para suportar condições de múltiplo estresse, encontradas em destilarias brasileiras.The expansion biofuels participation in the world energy matrix would help to extend the existence of fossil fuel reservoirs, mitigate the threats of climate change, and enable a better security of energy supply. The Brazilian process of ethanol production from sugarcane has gained an important role in the global energy scenario, for the high yield and low production cost. S. cerevisiae species is widely used in industrial fermentations for being resistant, but the Brazilian process imposes a variety of stressing factors to the yeast, affecting its metabolism and growth. The Very High Gravity Fermentation is performed by the utilization of musts with high sugar concentration and is one of the most efficient ways for obtaining high ethanol levels. However, this technology causes additional deleterious effects to the yeast. In this context, increasing yeast tolerance is of fundamental importance for a satisfactory fermentative performance. In this study we assessed S. cerevisiae strains - isogenic to the industrial strain CAT-1 - with over expression of TRP1 and MSN2 genes involved to tryptophan biosynthesis and in general stress response, respectively. These strains were evaluated for their potential to perform fermentations with high ethanol content, simulating the conditions of Brazilian distilleries. The results showed that the MSN2 gene in the truncated version improved strain mainly to respond to the osmotic stress, increasing in fermentation velocity and the consumption of sugars. The TRP1 gene overexpression promoted higher growth in YEPD medium with 8% ethanol, however, decreased viability at concentrations above this level. The present work also evaluated the effect of amino acid supplementation on the physiology of the CAT-1 strain in YNB medium and in molasses and syrup of sugarcane. Histidide supplementation increased the growth and cell viability in the different media tested. In addition to histidine, the amino acids lysine and alanine increased the growth of CAT-1 in molasses. Supplementation of tryptophan and asparagine also promoted increased cell viability in sugarcane syrup. On the other hand, in microplate assays, cysteine supplementation decreased growth in YNB medium with 10 and 12% ethanol, and in molasses with 20% ART. The results indicate that both genetic engineering and amino acid supplementation may be viable alternatives to increase tolerance of S. cerevisiae to supporting multiple stress conditions typical in Brazilian distilleries