Molecular mechanisms underlying the action of histone deacetylases inhibitors (HDACIs) in ovarian cancer

ABSTRACT: Epithelial ovarian cancer (EOC) is the most lethal gynecological malignancy, despite advances in treatment. The most common histological type, high grade serous carcinoma (HGSC) is usually diagnosed at an advanced stage, and although this type of tumors frequently responds to surgery and platinum-based chemotherapy, they usually recur. Ovarian clear cell carcinoma (CCC) is an unusual histological type, which is known to be intrinsically chemoresistant and is associated with poor prognosis in advanced stages. Hence, the discovery of new therapeutic strategies urges and the fact that histone deacetylases (HDACs) expression is increased in ovarian cancer points out HDAC inhibitors (HDACIs) as an attractive approach. Our hypothesis is that HDACIs are useful drugs to treat ovarian cancer. So, the main goal was to disclose the molecular mechanisms underlying the action of HDACIs in ovarian cancer. We investigated the expression profile of HDAC, class I (HDAC1, 2, 3) and class II (HDAC4, 6 and phosphoHDAC4/5/7) in ovarian cancer. HDACs protein expression was analyzed by immunohistochemistry on tissue microarrays (TMA) from 64 patients with ovarian cancer (49 cases of HGSC and 15 cases of CCC). Our results showed that HGSC expressed HDAC1, 2, 3, 4, 6 and phosphoHDAC4/5/7 whereas CCC expressed HDAC1, 2 and 6. HDAC2, 3, 4 and pHDAC4/5/7 were associated with HGSC type. Kaplan-Meier curves showed that HDACs expression was not associated with survival. We also evaluated the association of HDACs expression profile with the cell cycle markers and we found that HDAC1 expression was statistically associated with p21 expression in HGSC. In order to understand the effects of HDACIs we used cancer cell lines (OVCAR3 and ES2) exposed to HDACIs, butyric acid and vorinostat, 5-aza-2´-deoxycytidine (DNA methylation inhibitor) and carboplatin and paclitaxel (standard chemotherapy) alone and combined. Analysis of cell death, proliferation and migration in cancer cell lines was performed. Our results showed, that both HDACIs induced cell death, mainly through apoptosis in the two cell lines. This result was further confirmed in ES2 cell line exposed to vorinostat, by the study of immunofluorescence of cleaved caspase 3 and the ratio of BAX/BCL-2 proteins, which increased after vorinostat exposure. Cell migration was decreased by vorinostat in both cancer cell lines. Our results also indicated that the association of different drugs were able to potentiate the effect of standard chemotherapy, mainly in ES2 cell line (CCC), supporting that EOC treatment can benefit from combined chemical and epigenetic therapy. Considering that CCC is a unique clinical, histopathological and molecular entity within ovarian cancer and having HNF1β as a pivotal pro-survival gene we evaluate the role of HNF1β in cell cycle arrest and apoptosis in CCC upon vorinostat exposure. Our results showed that vorinostat induced increased levels of HNF1β and at the same time cell cycle arrest and apoptosis in ES2 cells. This effect on HNF1β is associated with increased acetylation load of HNF1β. This study confirms that epigenetic modulation affects not only the conformation of chromatin and gene expression, but also it may alter the function and the turnover of proteins other than histones. Also, epigenetic modulation of signaling pathways have been reported in HGSC and CCC, including the overexpression of Notch pathway elements and we investigated the modulation of the Notch pathway by vorinostat in ovarian cancer. Using immunofluorescence and quantitative polymerase chain reaction, our results revealed that vorinostat activated the Notch pathway in CCC and HGSC cell lines, through different Notch ligands. The activation of Notch pathway by vorinostat, in CCC and HGSC cell lines, culminated in the increased expression of the same downstream transcription factors, hairy enhancer of split (Hes1) 1 and 5, and Hes-related proteins 1 and 2. Therefore, vorinostat modulates the expression of several downstream targets of the Notch pathway and independent Notch receptors and ligands that are expressed in HGSC and CCC. This upregulation of the Notch pathway may explain why vorinostat therapy fails in ovarian carcinoma treatment, as shown in certain clinical trials. We also established a cell line from ascitic fluid from a patient with HGSC, who had been previously treated with neoadjuvant chemotherapy. The cell spontaneous immortalization was obtained on 2D cell culture and expansion was performed on 2D and 3D cell cultures. Characterization studies confirmed that IPO-SOC43 cell line is of EOC origin and maintains morphological and molecular features of the primary tumor. The success of the cell line growth in a 3D systems, allows it to be used in more complex assays than those performed in 2D models. IPO-SOC43 is available for public research and we hope it can contribute to enrich the in vitro models addressing EOC heterogeneity, being useful to investigate EOC and to develop new therapeutic modalities. In conclusion, the results in vitro proved that there is benefits of combined therapy, using drugs with action of epigenetic modulation and conventional therapy. This thesis also pave the path for future studies on the role of HDACs cancer cells pathophysiology, serving as markers for the design of personalized and specific therapeutic strategies.RESUMO: O carcinoma do ovário é a neoplasia ginecológica mais letal. Vários fatores são identificados como responsáveis pela baixa eficácia no tratamento do carcinoma do ovário. Assim, é postulado que a elevada taxa de mortalidade se deve principalmente, a dificuldades no diagnóstico da doença numa fase inicial e à resistência à terapêutica convencional. Deste modo, a investigação de novas estratégias terapêuticas é essencial e urgente. A expressão aumentada das desacetilases de histonas (HDAC) identificada em carcinomas do ovário pode indicar que os inibidores de HDACs (HDACIs) possam ser uma alternativa terapêutica. Os HDACIs são uma classe de agentes anti-neoplásicos, que bloqueiam a desacetilação de histonas e outras proteínas, causando paragem do ciclo celular, diferenciação e/ou apoptose das células neoplásicas. Vários HDACIs estão a ser testados em ensaios clínicos, quer como agentes únicos quer em terapias combinadas, apresentando alguns resultados positivos no combate a vários tumores sólidos e hematológicos. Os mecanismos moleculares do efeito anti-tumoral dos HDACIs não estão completamente esclarecidos, nem a avaliação da sensibilidade e/ou resistência das células a fármacos com influência na regulação epigenética. O cancro do ovário é um conjunto vasto de neoplasias distintas sendo os carcinomas o grupo mais prevalente. Atualmente, não é possível, de modo fiável prever o curso clínico da doença nem a resposta individual à quimioterapia. No entanto, a identificação morfológica do tipo de carcinoma do ovário tem valor prognóstico independente em análise multivariada, pelo que a avaliação de potenciais biomarcadores que possam constituir alvos terapêuticos deverá ser efetuada de modo independente, pois previsivelmente cada tipo histológico deverá ter uma resposta específica ao tratamento. Por estas razões, a hipótese geral desta tese é que os HDACIs são fármacos úteis no tratamento do cancro do ovário, sendo o objetivo a avaliação de mecanismos subjacentes à ação destes fármacos em carcinomas de ovário de modo a permitir uma terapêutica mais eficaz. Neste projeto foram estudados apenas dois tipos histológicos de carcinoma do ovário: seroso de alto grau (HGSC), que é o mais frequente e o carcinoma de células claras (CCC) que apesar de pouco frequente é atualmente resistente à terapia convencional. Assim, um dos primeiros objetivos desta tese foi caracterizar o perfil de expressão das HDACs em carcinomas do ovário e validar a relevância de testar HDACIs como agentes de regulação epigenética, no tratamento do carcinoma do ovário. Os resultados em doentes com cancro do ovário mostram que o perfil de expressão das HDACs se associa ao tipo histológico. No HGSC verifica-se uma associação das HDACs 2, 3, 4 e das HDAC4/5/7 fosforiladas, enquanto que no carcinoma de células claras (CCC), as HDAC1, 2 e 6 apresentam níveis elevados de expressão e verifica-se uma diminuição da expressão da HDAC3, HDAC4 e das HDAC4/5/7 fosforiladas. A expressão das HDACs 2, 3, 4 e das HDAC4/5/7 fosforiladas estão associadas ao tipo histológico sendo mais expressas no HGSC. A expressão da HDAC3 está ainda associada a parâmetros clínicos, nomeadamente ao estádio mais avançado e à metastização; bem como a HDAC4c e a HDAC4/5/7 fosforiladas. Considerando que as HDACs estão sobre-expressas nestes tipos histológicos de carcinomas do ovário, seguidamente, pretendemos avaliar o efeito epigenético dos HDACIs em modelos in vitro de carcinoma de ovário e compreender as alterações decorrentes da exposição aos HDACIs, bem como perceber o efeito destes na dinâmica molecular e viabilidade celular. Para tal, usamos duas linhas celulares, de dois tipos histológicos já avaliados, uma linha de HGSC - OVCAR3 e uma linha celular de CCC - ES2. Os resultados indicam que os HDACI induzem a morte celular em ambas as linhas celulares, principalmente através da apoptose, avaliada por citometria de fluxo. Este resultado foi evidenciado na linha celular ES2 exposta ao vorinostat, pelo estudo da imunofluorescência da caspase 3 clivada e da avaliação da razão das proteínas BAX/BCL-2, que aumentou após a exposição ao vorinostat. Os resultados também indicam que a associação de diferentes tipos de fármacos potencia o efeito da quimioterapia convencional e os HDACIs, em particular o vorinostat, tendo um efeito cumulativo na morte celular, principalmente na linha celular ES2 (CCC). A migração celular também é afetada pelo vorinostat em ambas as linhas celulares de carcinoma de ovário. Os resultados mostram também que o vorinostat induz aumento do HNF1β e ao mesmo tempo paragem do ciclo celular e apoptose nas células ES2. O aumento da expressão do HNF1β é acompanhado pelo aumento dos seus níveis da acetilação. Este estudo confirma que a modulação epigenética afeta a conformação da cromatina e da expressão genética, mas também pode alterar a função e o turnover de outras proteínas além das histonas. Pela primeira vez é observado que a proteína HNF1β pode ser acetilada, contudo serão necessários mais estudos para validar o papel da acetilação na função e degradação da proteína HNF1β. Nesta tese foi avaliado também a modulação de outras vias de sinalização importantes no carcinoma do ovário, como por exemplo a via Notch através da exposição a HDACIs, nomeadamente vorinostat e ácido butírico. E os nossos resultados mostram que o vorinostat ativa a via Notch nas linhas celulares de CCC e HGSC, através de diferentes ligandos da via Notch. No CCC, a ativação da via Notch parece ocorrer através dos ligandos Delta (Dll) 1, 2 e 3, enquanto nos HGSC, os ligandos Dll1, Jagged 1 e 2 são os mais expressos. A ativação da via Notch pelo vorinostat, em ambas linhas celulares, culminou na expressão aumentada dos mesmos genes alvo da via Notch, Hes1 e 5 e Hey 1 e 2. Assim, o vorinostat modula a expressão de vários fatores de transcrição da via Notch, independentemente do painel de receptores e dos ligandos expressos nas linhas de HGSC e CCC. Esta redundância da via Notch pode explicar porque a terapêutica isolada com vorinostat falha no tratamento do carcinoma do ovário, como observado em vários ensaios clínicos. Por fim, no decorrer dos trabalhos apresentados, e considerando a importância das linhas celulares na compreensão da biologia do cancro e nos mecanismos de sensibilidade e resistência das células aos fármacos, foi estabelecida uma linha celular, IPO-SOC43 a partir de líquido ascítico de uma doente com HGSC que havia sido previamente tratada com quimioterapia neoadjuvante.Foram efetuados estudos de caracterização desta linha que demonstram que a linha celular IPO-SOC43 é de origem epitelial e que mantém características morfológicas e moleculares do tumor primário. As células mantêm-se em cultura em monocamada (2D) e em agregados em 3D, com taxas de proliferação e viabilidade dentro do esperado para uma linha neoplásica maligna. O sucesso da viabilidade em culturas 3D permite o seu uso em ensaios mais complexos, nomeadamente, na análise da contribuição dos vários componentes do microambiente tumoral na progressão da doença e resposta à terapêutica. A linha celular IPO-SOC43 está disponível para ser utilizada experimentalmente e esperamos que possa contribuir para enriquecer os modelos in vitro que abordam a heterogeneidade dos EOC e desenvolver novas modalidades terapêuticas. Em suma, os resultados contribuem para a implementação racional de novas e diferentes abordagens terapêuticas. Os resultados mostram que in vitro há benefício de terapêutica combinada, utilizando fármacos com ação de modelação epigenética e terapia convencional. Esta tese também abre caminho para estudos futuros mais detalhados sobre a função das HDACs na dinâmica celular e não só na regulação epigenética, bem como também na análise de mecanismos subjacentes à ação de proteínas codificadas por genes relevantes em cada tipo histológico de carcinoma do ovário. Espera-se assim, que a compreensão dos mecanismos subjacentes à ação dos fármacos envolvidos na regulação epigenética possa fornecer orientações para estratégias terapêuticas mais específicas e personalizadas