MicroRNA involvement in breast cancer susceptibility and progression

RESUMO: Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes com função reguladora que regulam a expressão génica ao ligar-se a sequências específicas na região 3’ UTR dos mRNAs. Diversos estudos mostraram que os miRNAs regulam mecanismos fundamentais para o normal funcionamento celular, como crescimento celular, proliferação, diferenciação e apoptose. A expressão de alguns miRNAs é alterada em diversos tipos de cancro, nomeadamente em cancro da mama. Estudos de análise funcional em linhas celulares mostraram que os miRNAs podem funcionar como supressores de tumor ou ter actividade oncogénica. Assim, o valor clínico dos miRNAs como potenciais marcadores para cancro da mama está a ser amplamente estudado de momento. No entanto, apenas se conhecem efeitos de alguns miRNAs. A maior dificuldade, neste âmbito, depreende-se com a identificação de possíveis alvos com relevância biológica para cancro da mama. Visto que os programas bioinformáticos predizem um elevado número de falsos positivos e falsos negativos, é de extrema importância identificar experimentalmente alvos relevantes. Nesta tese procuramos explorar diferentes abordagens da influência de miRNAs em cancro da mama. Começamos por estudar os mecanismos que estão por trás da regulação dos próprios miRNAs. Colocámos a hipótese de serem mecanismos epigenéticos, tais como a metilação de citosinas no DNA, que estão a influenciar os níveis de expressão dos miRNAs. Para tal, tratámos linhas celulares de mama com um agente capaz de desmetilar o DNA e verificámos que os níveis de miRNAs são alterados. Contudo, não conseguimos encontrar uma associação entre a metilação de ilhas CpG nas regiões promotoras dos genes que codificam para os miRNAs. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de os níveis de expressão de miRNAs estarem a ser regulados por metilação das suas zonas promotoras, dado que não estudámos todas as regiões promotoras existentes. De seguida, abordámos a influência de dois miRNAs, miR-200c e miR-203, na resistência para fármacos dirigidos a cancro da mama, nomeadamente, Paclitaxel e 5-fluoruacil. Para tal fizemos expressar ambos os miRNAs na linha celular MDA-MB-231 e inibir os mesmos na linha celular MCF-7. Infelizmente não fomos capazes de encontrar significado estatístico nos resultados obtidos. Contudo pudemos concluir que o miR-200c parece ter um efeito contrário nas linhas MCF-7 e MDA-MB-231 no que diz respeito ao tratamento com Paclitaxel e o miR-203 parece aumentar a resistência para o mesmo comporto na linha celular MDA-MB-231. O tratamento com 5-fluoruacil não mostrou qualquer diferença em ambas as linhas. Dado que os estudos in vitro, nesta área, devem ser transpostos para humanos e/ou tecidos humanos, seguidamente procurámos estudar os níveis de expressão do miR-200c e do miR-203 em tecido tumoral mamário, bem como a expressão de dois alvos hipotéticos encontrados utilizando ferramentas bioinformáticas, SIX1 e SOX2. Relativamente ao miR-200c, não encontrámos quaisquer diferenças entre tecido normal e tecido tumoral de mama, nem conseguimos relacionar este miRNA com características clinicopatológicas. Comparativamente detectaram-se diferenças para o miR-203 e conseguimos relacionar este com os estadios iniciais de desenvolvimento tumoral. Conseguimos também demonstrar que o miR-203 pode ser um potencial marcador para discriminar os tumores lobulares invasivos. No que diz respeito à expressão do SOX1 e SOX2, observámos que ambos possuem uma incidência baixa na nossa população e que não se associam com a expressão dos miRNAs em estudo. Por último, procurámos validar alguns alvos do miR-200c e do miR-203. Para tal, efectuámos um estudo comparativo de proteómica, onde fizemos expressar o miR-200c e o miR-203 na linha celular MDA-MB-231 e inibimos os mesmos miRNAs na linha celular MCF-10A. Este estudo exploratório, ainda por terminar, revelou aproximadamente 3000 proteínas diferentemente expressas nas linhas celulares. No entanto, até ao momento conseguimos reduzir esta vasta lista para uma menor com aproximadamente 10 proteínas para cada linha celular. De futuro, serão seguidas outras abordagens para validar estes alvos hipotéticos. Devido ao facto da população recolhida ser recente, o seguimento clínico nos próximos anos permitirá tirar algumas conclusões relativas à resistência à terapia utilizada e a sua relação com a expressão dos miRNAs em estudo.ABSTRACT: MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding regulatory RNAs that modulate gene expression by binding to their target mRNAs. By these means, miRNAs control normal rates of all major cellular pathways. A subset of miRNAs, which are differentially detected between normal and tumour tissue samples, has been identified in breast cancer, and functional analysis in cell line systems has revealed tumour suppressive and oncogenic functions of some of these miRNAs. Hence, the clinical value of these as novel biomarkers for cancer is being actively investigated. However, the function of only a few of these miRNAs in breast cancer has been investigated. One major difficulty is the identification of target mRNAs and proteins with biological significance in breast cancer and consequently the identifications of the pathways they influence. Given the relatively high rates of both false-positives and false-negatives from current miRNAs targets prediction programs, it is critically important to experimentally identify relevant miRNAs targets and the pathways involved in carcinogenesis. In this thesis our main goal was to study the role of miRNAs in breast cancer. Thus, we started by addressing the mechanisms behind regulation of miRNAs expression levels. We hypothesized if that epigenetic mechanisms, such as DNA methylation, could influence miRNAs expression levels. Therefore, we treated breast cell lines with demethylating agents and observed that miRNAs expression levels were altered. However, we failed to prove a direct correlation between the methylation of CpG islands in promoter regions of the miRNAs studied and their expression. Nevertheless, we cannot exclude the possible regulation of miRNAs levels by methylation since we did not study all possible promoter regions of miRNAs genes as their promoter regions have not been fully identified. Next, we addressed the possible effect of miRNAs in breast cancer therapy resistance. For that, we treated breast tumour cell lines with Paclitaxel and 5-fluoruacil, two known chemotherapeutics used in breast cancer, with the ectopic expression or inhibition of miR-200c and miR-203. Unfortunately, we did not find any statistical difference between untreated and treated cells. However, miR-200c seems to have contrary effects in MCF-7 and MDA-MB-231 cells regarding treatment with Paclitaxel and miR-203 seem to augment resistance to Paclitaxel in MDA-MB-231 cells. Both miRNAs did not show any effect in cells treated with 5-Fluoruacil. Since in vitro studies, always lack studies using human tissues. We subsequently studied the expression levels of miR-200c and miR-203 in breast tumour tissues and two putative targets found by bioinformatics tools, SIX1 and SOX2. Concerning miR-200c, we did not detect significant differences between normal breast and tumour tissues in our population. Additionally, we failed to correlate miR-200c with clinicopathological features. Regarding miR-203, we detect statistically differences between normal and tumour tissue and it seems that miR-203 is involved in breast cancer development, mainly in early stages of development. We also show that miR-203 might be a potential marker to discriminate stages in invasive lobular carcinoma. About the expression levels of SIX1 and SOX2, we observe relatively low levels of both proteins through immunohistochemistry and do not found any statistically difference between their expression and their regulators, miR-200c and miR-203. Finally, we address the validation of putative targets of the miR-200c and miR-203. Thus, we conducted a comparative proteomic study to find differently expressed proteins when miR-200c and miR-203 were ectopically expressed or inhibited in breast cell lines. This exploratory study, until now, revealed a small list out of approximately 3000 proteins that are putative targets of both miRNAs and are differently expressed. Further studies will be conducted in order to validate these putative targets. With this thesis, we believe we provide new insight into the involvement of miRNAs in breast cancer and also important knowledge of how miRNAs levels are being regulated and also in the discovery of new targets. We also gathered a considerable study population during this thesis, which allow future correlations on therapy outcomes and survival with the biomarkers studied