Efflux pump activity in drug resistance of Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus é um importante agente patogénico, para o qual estão descritos vários mecanismos de resistência a compostos antimicrobianos, sendo a resistência mediada por bombas de efluxo (MDR-EP) o menos bem caracterizado. Foi objectivo desta Dissertação avaliar a contribuição global destes sistemas de efluxo, em particular, de NorA, Smr e QacA, para a resistência a fluoroquinolonas e a outros compostos antimicrobianos em S. aureus. Foi estudada uma colecção de isolados clínicos de S. aureus resistentes à ciprofloxacina e estirpes de referência. A actividade de efluxo foi avaliada por metodologias baseadas no transporte de brometo de etídeo (EtBr), substrato de MDR-EPs, e pela determinação da concentração mínima inibitória para substratos de MDR-EPs na presença/ausência de inibidores de efluxo. A informação obtida foi complementada pela análise por RT-qPCR da expressão de genes que codificam para as principais MDR-EPs de S. aureus e seus reguladores e pesquisa de mutações associadas aos principais fenótipos de resistência estudados. A relevância de NorA para a resistência aos compostos antimicrobianos foi analisada através da resposta de S. aureus ao stress imposto pelo EtBr. Demonstrou-se que a presença/ausência deste composto promove o aumento/decréscimo da expressão do gene norA com consequente redução/aumento da susceptibilidade a fluoroquinolonas, biocidas e corantes. Foram também analisados os alelos de norA dos isolados clínicos, tendo sido verificada a predominância do alelo norAI. Estes estudos evidenciaram a complexidade da regulação deste sistema, com a identificação de múltiplos factores que contribuem para a modelação da expressão de norA e actividade de NorA. Em relação às bombas codificadas em plasmídeos, verificou-se que tanto QacA, codificada num plasmídeo associado à multirresistência, como Smr, codificada num plasmídeo sem genes de resistência adicionais, desempenham um papel importante na resistência a biocidas, podendo contribuir para a persistência e disseminação em ambiente hospitalar de estirpes resistentes a biocidas e potencialmente resistentes a antibióticos. A caracterização global dos isolados de S. aureus de origem clínica revelou uma contribuição significativa do efluxo para a resistência aos compostos antimicrobianos, com a identificação de um grupo de isolados com actividade de efluxo aumentada e correlacionável com susceptibilidade reduzida a fluoroquinolones e biocidas. A incubação com inibidores de efluxo, em particular as fenotiazinas, promoveu uma redução dos níveis de resistência, sem contudo resultar na reversão do fenótipo de resistência. Os estudos de expressão génica não revelaram uma correlação directa entre maior actividade de efluxo e expressão génica, sugerindo que os isolados clínicos podem já estar adaptados para uma resposta por efluxo na presença de compostos nocivos. Observou-se ainda uma multiplicidade de respostas mediadas por efluxo aos diferentes substratos e suas concentrações, variáveis no padrão temporal de expressão génica, níveis de expressão e genes envolvidos. Os resultados obtidos evidenciam que o efluxo constitui parte da resposta inicial da célula aos compostos antimicrobianos, a qual, no caso das fluoroquinolonas, é seguida pela aquisição de mutações nos genes alvo. Mostrou-se ainda que a pressão exercida por biocidas induz a resistência cruzada a fluoroquinolonas. Em resumo, os resultados descritos nesta Dissertação demonstram a contribuição do efluxo para a emergência de resistência a fluoroquinolonas e outros compostos antimicrobianos e o seu papel na emergência de estirpes de S. aureus multirresistentes em ambiente hospitalar.Staphylococcus aureus is a major human pathogen, for which several resistance mechanisms have been described. Ofthese, resistance mediated by multidrug efflux pumps (MDR-EP) is characterizedto a lesser extent. The aim of this Dissertation was to evaluate the overall contribution of MDR-EP, in particular, of NorA, Smr and QacA to S. aureusresistance towards fluoroquinolones and other antimicrobials. Thecollection studied comprisedciprofloxacin-resistantS. aureusclinical isolates plus reference strains was studied. Efflux activity was assessed by methodologies based on the MDR-EP substrate ethidium bromide (EtBr) and determination of minimum inhibitory concentrations of MDR-EP substrates in the presence/absence of efflux inhibitors. RT-qPCR was used to evaluate the expression level of MDR-EP genes and their regulators. Mutations associated with resistance were screened in genes of interest. The relevance of NorA to antimicrobial resistance was analyzed in the S. aureusstress response to EtBr. It was shown that the presence/withdrawal of this compound promoted an increase/decrease of norAexpression level and subsequent reduction/increase of susceptibility towards fluoroquinolones, biocides and dyes. We also analyzed the norA alleles within the clinical isolates collection and found that norAIwas the prevalent allele.The results obtained substantiated the intricate regulatory system of NorA, with the identification of multiple factors that contributed to the modulation of the norAgene and NorA activity.The study of QacA, encoded on a multiresistance plasmid and Smr, encoded on a small plasmid with no additional resistance genes, revealed their important role on the resistance to biocides in the isolates that carry these determinants. Overall, the data indicates that these MDR-EPs and respective plasmids may contribute tothe persistenceand proliferation of biocide-resistant strains and potentially antibiotic-resistant strainsin the hospital environment.The characterization of the clinical isolates collection revealed efflux as an important component of resistance, with detection ofa group of isolates with increased efflux activity, which could be correlated with increased resistance to fluoroquinolones, biocides and dyes. The efflux inhibitors tested, in particular phenothiazines, were efficient in reducing resistance levels, yet without promotingreversion of the resistance phenotype. Gene expression assays revealed no direct correlation between increased efflux activity and levels of gene expression, suggesting that clinical isolates may be primed to efflux noxious compounds. A multiplicity of efflux-mediated responses to different inducers and their concentrationswas observed, varying in the temporal pattern of expression, genes overexpressed and levels of expression.The results obtained support the role of efflux as a first-line response of S. aureusto antimicrobial compounds, which in the case of fluoroquinolones, is followed by occurrence of target-based mutations. Evidence was also obtained showing that the pressure exerted by biocides can lead to cross-resistance to fluoroquinolones.In summary, the results described in this Dissertation demonstrate that efflux contributes to resistance towards fluoroquinolones and biocides and plays a key role on the emergence ofS. aureusmultiresistant strains in the healthcare environment