Dinâmica fisiológica e mutacional da multirresistência em Mycobacterium tuberculosis

A tuberculose multirresistente é causada por estirpes de Mycobacterium tuberculosis resistentes à isoniazida e rifampicina, os dois principais antibacilares. Neste trabalho pretendemos compreender qual(is) o(s) mecanismo(s) que leva(m) ao desenvolvimento da multirresistência, expondo a estirpe de referência M. tuberculosis H37Rv e a estirpe clínica monorresistente à rifampicina 359/03 a concentrações constantes de isoniazida e rifampicina. As culturas iniciais e adaptadas foram caracterizadas fenotipicamente em termos de tempos de crescimento, testes de susceptibilidade e determinação de concentrações mínimas inibitórias, na ausência ou presença de inibidores de bombas de efluxo. A caracterização genotípica incidiu na pesquisa de eventuais alterações em zonas específicas dos genes katG, inhA e rpoB, por PCR e hibridação reversa e na quantificação da expressão dos genes de cinco bombas de efluxo por qRT-PCR. A análise comparativa das culturas iniciais e das culturas adaptadas a 0.1 μg/ml de isoniazida, revelou que, após 3 semanas de exposição à isoniazida, a cultura H37Rv tornou-se resistente a este antibiótico, sendo este fenótipo revertido pelo inibidor de bombas de efluxo verapamil. A análise por qRT-PCR desta cultura revelou a sobrexpressão de todos os genes de bombas de efluxo analisados. A cultura de H37Rv obtida no final do processo de adaptação mantém-se resistente à isoniazida, apresentando uma delecção no gene katG. Com a exposição à isoniazida, a estirpe 359/03 tornou-se multirresistente. Novamente, este fenótipo é revertido pelo verapamil. A análise por qRT-PCR revelou a sobrexpressão de todos os genes de bombas de efluxo analisados, não tendo sido detectadas alterações nos outros alvos genéticos testados. Em relação à exposição das estirpes H37Rv e 359/03 a 1 μg/ml de rifampicina, não se verificaram alterações significativas, quer a nível fenotípico, quer a nível genotípico. Os resultados obtidos ilustram in vitro diferentes estratégias através das quais M. tuberculosis pode responder quando exposto às concentrações clinicamente relevantes de um dado antibiótico e que podem resultar na emergência da multirresistênciaMultidrug resistant tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis strains resistant to both isoniazid and rifampicin, the main antibacillary used in tuberculosis therapy. In this work we intended to understand the mechanism(s) by which multiresistance develops, exposing the M. tuberculosis H37Rv reference strain and the clinical strain monoresistant to rifampicin 359/03 to constant concentrations of isoniazid and rifampicin. The initial and antibiotic-adapted cultures were phenotypically characterized in terms of growth period, antibiotic susceptibility testing and minimum inhibitory concentration determination in the presence or absence of efflux pump inhibitor. Genotypic characterization included analysis of specific regions of the katG, inhA and rpoB genes by PCR and reverse hybridization protocols and evaluation of expression level of genes coding for five efflux pumps by qRT-PCR. Comparison of the initial and the cultures exposed to 0.1 μg/ml of isoniazid showed that after 3 weeks exposition to isoniazid, the H37Rv culture became resistant to the antibiotic, a phenotype reversed by the efflux pump inhibitor verapamil. qRT-PCR of this culture detected over-expression of all efflux pump genes tested. The culture obtained at the end of the isoniazid exposure process, was resistant to isoniazid, presenting a deletion in the katG gene. When strain 359/03 was exposed to isoniazid, it became multiresistant. Again, this phenotype is reverted by verapamil. qRT-PCR analysis of this culture detected over-expression of all efflux pump genes tested, with no alterations detected in the other genotypic targets screened. No significant alterations were detected when H37Rv and 359/03 strains were exposed to 1 μg/ml rifampicin, both in terms of phenotypic and genotypic characterization. Overall, these results illustrate in vitro different strategies by which M. tuberculosis strains respond when exposed to clinically relevant concentrations of a given antibiotic, all of which may ultimately result in the emergence of multiresistance