Avaliação do envolvimento das bombas de efluxo na fármaco-resistência ao praziquantel em Schistosoma Mansonii

O Praziquantel (PZQ) é o fármaco de primeira linha no tratamento da schistosomose, com alta taxa de cura e sem efeitos secundários significativos. Têm sido reportados cada vez mais casos de resistência ou de aumento de tolerância a este fármaco, aumentando as preocupações de emergência de estirpes resistentes ao PZQ. O Verapamil, um bloqueador de canais de cálcio, inibe o fluxo de fármaco activo e tem sido descrito como um bom inibidor das glicoproteínas-P (P-gp), sendo, por isso, utilizado em diversos estudos de fármaco-resistência. No laboratório de Helmintologia da Unidade de Ensino e Investigação em Parasitologia Médica do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, foi seleccionada uma linha de S. mansoni, resistente a 800 mg/Kg de PZQ, após pressão de fármaco constante e crescente ao longo de vários ciclos. Para confirmar a existência de diferenças polimórficas entre a estirpes sensível e resistente de S. mansoni, extraiu-se o DNA de parasitas adultos de ambas as estirpes de S. mansoni e analisou-se por Random Amplified Polymorphic DNAPolymerase Chain Reaction (RAPD-PCR). As diferenças polimórficas entre a estirpe sensível e a resistente foram observadas e calculou-se o coeficiente de similaridade (Dice’s coefficient). Após confirmar a existência de polimorfismos entre as duas estirpes, a atividade das bombas de efluxo foi avaliada em ambas as estirpes. A avaliação foi realizada num ensaio de acumulação usando o composto Brometo de Etídio na presença e ausência de Verapamil. O papel das bombas de efluxo na resistência ao PZQ, foi ainda investigado comparando a resposta dos parasitas da estirpe sensível e resistente ao fármaco na ausência e na presença de diferentes doses de Verapamil, em cultura in vitro. Os resultados obtidos foram reforçados comparando os níveis e expressão do gene SmMDR2 em ambas as estirpes isogénicas por Real-Time PCR (qPCR). A estirpe resistente de S. mansoni, necessitou de concentrações mais elevadas de inibidor quando comparada com a estirpe sensível para obter níveis significativos de fluorescência de Brometo de Etídio. A cultura in vitro mostrou uma dose letal de PZQ mais elevada na estirpe resistente do que na estirpe sensível na ausência de Verapamil. Na presença de Verapamil houve uma redução na dose letal de PZQ nos machos de ambas as estirpes, sendo esta redução mais acentuada nos machos da estirpe resistente. As fêmeas não mostraram alterações significativas na dose letal de PZQ na presença e ausência e inibidor. Os resultados foram reforçados pela observação dos níveis do gene SmMDR2, onde os machos da estirpe resistente mostraram ter os maiores níveis de expressão e pelo aumento de expressão nos machos de ambas as estirpes após exposição ao PZQ. As fêmeas de ambas as estirpes não tiveram diferenças significativas na expressão do gene após exposição ao PZQ e as fêmeas da estirpe resistente tiveram mostraram ter os níveis de expressão do gene SmMDR2 mais baixos entre os machos e fêmeas de ambas as estirpes. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que os machos da estirpe resistente têm maior atividade de bombas de efluxo do que os machos da estirpe sensível e que as bombas P-gp estão envolvidas na resposta e no aumento de tolerância dos machos de S. mansoni ao PZQ.Praziquantel (PZQ) is the drug of choice in the treatment of schistosomiasis due to its high cure rates and no significant side effects. Currently, more and more cases of resistance or increased tolerance to PZQ have been reported, growing concerns regarding the emergency of resistant strains. Drug resistance in helminths may involve efflux pumps such as members of ATP-binding cassette transport proteins, including P-glycoproteins (P-gps) coded by the SmMDR2 gene in S. mansoni. Verapamil has been described has a P-gp inhibitor, therefore, it has been used in several drug-resistance studies. In our laboratory, we selected a parasitic line of S. mansoni, through constant drug pressure over several cycles, which was resistant to 800 mg/kg PZQ. To confirm the existence of polymorphic differences between the resistant and sensitive strain of S. mansoni, the DNA of adult parasites of S. mansoni from both strains was extracted and analyzed through Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR). The polymorphic differences between susceptible and resistant parasites were observed and the similarity coefficient (Dice's coefficient) was calculated. After confirming the existence of polymorphisms between strains, the efflux pumps activity was evaluated in both strains. The evaluation was performed trough an ethidium bromide accumulation assay in the presence and absence of Verapamil (P-gp inhibitor). The role of efflux pumps in resistance to PZQ was, further investigated comparing the response of the parasites of the susceptible and resistant strain to PZQ in the absence and presence of different doses of Verapamil, in in vitro culture. The results were reinforced through comparison of the expression levels of the SmMDR2 (coding for P-gp) gene in both isogenic strains by qPCR. The resistant strain of S. mansoni required higher concentrations of inhibitors than the sensitive strain in order to obtain significant levels of ethidium bromide retention. The in vitro culture showed a higher lethal dose of PZQ in the resistant strain in the absence of Verapamil. In the presence of Verapamil there was a decrease in the lethal dose of PZQ in males of both strains, being that reduction more evident in the males of the resistant strain. Females did not show significant changes of lethal dose of PZQ in the presence of inhibitor. These results were corroborated by the observation of the levels of SmMDR2 gene, were the males of the resistant strain showed the highest expression levels and by an increase of gene expression after exposure to PZQ in males of both strains. Females of both strains showed no significant changes in gene expression after exposure to PZQ, and the females of the resistant strain showed the lowest levels of SmMDR2 expression between males and females of both strains. The results obtained in this work showed that the males of the resistant strain have a higher efflux pump activity than the males of the sensitive strain, and that, in males, this activity is related with the response and increase of tolerance to PZQ