Pyruvate kinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficies and their association with malaria - population genetics and proteomic studies

A malária é reconhecida como uma das principais forças selectivas a actuar na história recente no genoma humano. Inúmeros polimorfismos genéticos têm sido descritos como protectores contra a gravidade da malária, como o alelo HbS (designado de traço falciforme) e o alelo G6PD A- (associado à deficiência de G6PD). Mais recentemente, também a deficiência de PK foi associada com a protecção contra a malária. Evidências desta associação foram obtidas em estudos com modelos de roedor e estudos in vitro utilizando GV humanos deficientes em PK. Até à data, não foram obtidos dados em populações humanas que revelem esta associação: ainda não foi identificada uma variante de PK com uma prevalência elevada em regiões endémicas de malária e não foram identificadas marcas de selecção na região do gene que codifica para a PK (gene PKLR). Além disso, os mecanismos subjacentes à protecção contra a malária por deficiências enzimáticas dos GV não estão bem esclarecidos. Assim, os objectivos do presente estudo foram: investigar os polimorfismos genéticos humanos com associação com a malária em Cabo Verde; pesquisar marcas de selecção da malária na região do gene PKLR em populações Africanas; determinar a frequência da deficiência em PK e identificar uma eventual variante da enzima que possa estar sob selecção positiva em regiões endémicas de malária; avaliar o efeito das duas deficiências enzimáticas (PK e G6PD) na invasão e maturação do parasita em culturas in vitro de Plasmodium usando GV normais e deficientes; e analisar o perfil proteómico de GV infectados e não infectados, normais e com deficiência (em PK e G6PD), bem como de parasitas isolados de GV tanto deficientes como normais. Em Cabo Verde (área epidémica), não foram identificadas marcas de selecção pela malária, através da análise dos vários polimorfismos. No entanto, quando a análise foi realizada em dois países endémicos (Angola e Moçambique), foram detectadas várias marcas de selecção: a genotipagem de microssatélites (STRs) e polimorfismos de base única (SNPs) localizados na vizinhança do gene PKLR revelou uma diferenciação consideravelmente maior entre as populações Africana e Europeia (Portuguesa), do que a diferenciação determinada aquando da utilização de marcadores genéticos neutros. Além disso, uma região genómica de maior amplitude apresentou um Desequilíbrio de Ligação (LD) significativo no grupo de malária não grave (e não no grupo de malária grave), sugerindo que a malária poderá estar a exercer pressão selectiva sobre a região do genoma humano que envolve o gene PKLR. No estudo que incidiu na determinação da prevalência da deficiência de PK no continente Africano (realizado em Moçambique), esta revelou-se elevada - 4,1% - sendo o valor mais elevado descrito até ao momento a nível mundial para esta enzimopatia. Na pesquisa de mutações que pudessem estar na causa deste fenótipo (baixa actividade de PK), foi identificada uma mutação não sinónima 829G>A (277Glu>Lys), significativamente associada à baixa actividade enzimática. Esta mutação foi também identificada em Angola, São Tomé e Príncipe e Guiné Equatorial, onde a frequência de portadores heterozigóticos foi entre 2,6 e 6,7% (valores que se encontram entre os mais elevados descritos globalmente para mutações associadas à deficiência em PK). Não foi possível concluir acerca da associação entre a deficiência de PK e o grau de severidade da malária e da associação entre o alelo 829A e a mesma, devido ao baixo número de amostras. Os resultados dos ensaios de invasão/maturação do parasita sugeriram que, nos GV com deficiência de PK ou G6PD, a invasão (onde está envolvida a membrana do GV hospedeiro e o complexo apical do parasita) é mais relevante para a eventual protecção contra a malária do que a maturação. Os resultados da análise proteómica revelaram respostas diferentes por parte do parasita nas duas condições de crescimento (GV com deficiência de PK e GV com deficiência de G6PD). Esta resposta parece ser proporcional à gravidade da deficiência enzimática. Nos parasitas que cresceram em GV deficientes em G6PD (provenientes de um indivíduo assintomático), a principal alteração observada (relativamente às condições normais) foi o aumento do número de proteínas de choque térmico e chaperones, mostrando que os parasitas responderam às condições de stress oxidativo, aumentando a expressão de moléculas de protecção. Nos parasitas que cresceram em condições de deficit de PK (GV de indivíduo com crises hemolíticas regulares, dependente de transfusões sanguíneas), houve alteração da expressão de um maior número de proteínas (relativamente ao observado em condições normais), em que a maioria apresentou uma repressão da expressão. Os processos biológicos mais representados nesta resposta do parasita foram a digestão da hemoglobina e a troca de proteínas entre hospedeiro e parasita/remodelação da superfície do GV. Além disso, uma elevada percentagem destas proteínas com expressão alterada está relacionada com as fendas de Maurer, que desempenham um papel importante na patologia da infecção malárica. É colocada a hipótese de que a protecção contra a malária em GV deficientes em PK está relacionada com o processo de remodelação da membrana dos GV pelo parasita, o que pode condicionar a invasão por novos parasitas e a própria virulência da malária. Os resultados da análise do proteoma dos GV contribuirão para confirmar esta hipótese.Malaria has been recognized as the strongest known force for evolutionary selection in the recent history of the human genome. Several human genetic polymorphisms have been described as protective against malaria severity, as the HbS allele (sickle cell trait) and G6PD A- allele (causing G6PD deficiency). More recently, PK deficiency has also been described as protective against malaria. Evidences were obtained in murine models and in vitro studies using PK-deficient human RBC. Human population data has not been obtained so far: a high prevalent PK variant has yet to be identified in malaria endemic regions and selection signatures in the genome region around RBC PKencoding gene (PKLR) have not been detected to date. Also, the mechanisms underlying malaria protection by RBC enzyme deficiencies are not clear. So, the objectives of this study were: to investigate malaria associated genetic traits in Cape Verde; to look for selection signatures in the PKLR gene region in African populations; to determine PK deficiency frequency and identify a prevalent PK variant that could be under selection by malaria in endemic African regions; to assess parasite invasion and maturation of Plasmodium falciparum growing in vitro in PK and G6PDdeficient and normal RBC; and to analyze the proteomic profile of non-infected and infected PK and G6PD-deficient and normal RBC as well as of parasites isolated from both deficient and normal host cells. In Cape Verde (epidemic area), no malaria selection signatures were found. However, when the analysis was performed in two malaria endemic countries (Angola and Mozambique), several selection marks were detected: data from Short Tandem Repeat (STR) and Single Nucleotide Polymorphic (SNP) loci spread along the PKLR gene region showed considerably higher differentiation between African and European (Portuguese) populations than that usually found for neutral markers, and a wider region showing strong Linkage Disequilibrium (LD) was found in the uncomplicated malaria group (and not in severe malaria group), suggesting that malaria may be shaping this genomic region in malaria countries. Additionally, when we performed the first study concerning the determination of PK deficiency prevalence in the African continent (in Mozambique), we were surprised with a high value: 4.1%. This was the higher frequency ever obtained for PK deficiency worldwide. Then, we looked for a mutation that could be in the origin of this phenotype and the missense mutation 829G>A (277Glu>Lys) was significantly associated. When we did a research of this mutation in other African countries (Angola, Sao Tome and Principe and Equatorial Guinea), the heterozygous carrier frequency was 2.6-6.7%, which is also among the highest heterozygous frequencies associated to PK deficiency described so far. We could not conclude about the association of PK deficiency and allele 829A with malaria outcome due to low sample number. Parasite invasion/maturation assays suggested that, in deficient RBC, the invasion step (or the cellular membranes) are more relevant for protection than maturation (the intracellular environment). Proteomic data from parasites growing in both G6PD and PK-deficient RBC revealed a distinct response from parasites growing in both deficient conditions, proportional to the phenotype severity. In parasites growing in G6PDdeficient RBC (asymptomatic individual), the main alteration was the increase of parasitic heat shock proteins and chaperones, showing that parasites are responding to oxidative stress conditions increasing the expression of protective molecules. In PKdeficient (transfusion-dependent individual with regular hemolytic crisis), a wider range of proteins displayed abundance alterations, the majority being down-expressed. The most represented biological processes in this response were hemoglobin digestion and protein trafficking/RBC remodeling. A high proportion of these altered proteins are related to Maurer’s clefts, which play important roles in the pathology of malaria infection. We hypothesized that protection against malaria in PK-deficient RBC is associated with the RBC membrane remodeling process by the parasite, which may lead to a reduction in invasion by new parasites and malaria virulence itself. Data on the RBC proteome will contribute to confirm this hypothesis