Caracterização estrutural de enzimas de molibdénio e suas chaperonas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em BiotecnologiaO molibdénio encontra-se no centro activo de diversas enzimas, presentes em todas as formas de vida. O passo final da produção destas proteínas é a inserção do cofactor modificado (Moco) e requer a acção de proteínas específicas, identificadas como chaperonas. O objectivo deste trabalho é compreender o funcionamento das chaperonas na inserção do Moco nas apoenzimas, utilizando várias técnicas como a Cristalografia de raios X, Small-Angle X-ray Scattering (SAXS) e Ressonância Plasmónica de Superfície (SPR). Assim pretende-se estudar a enzima de molibdénio aldeído oxidoredutase periplasmática ABC de Escherichia coli (PaoABC), a sua chaperona PaoD, bem como outras chaperonas da mesma família: a YqeB, também de E. coli e a XdhC de Rhodobacter capsulatus. Na presente dissertação descreve-se a resolução da primeira estrutura da PaoABC por cristalografia de raios X e SAXS. Usando polietilenoglicol (PEG), como agente precipitante, foi possível obter cristais desta proteína que permitiram a determinação da sua estrutura tridimensional a uma resolução de 1,87 Å. Recorrendo à técnica de SAXS foi possível obter um modelo a baixa resolução da PaoABC em solução. Em relação à chaperona PaoD, foram identificadas duas condições de cristalização, utilizando sulfato de amónio ou PEG como agentes precipitantes. Os cristais obtidos permitiram a recolha de dois conjuntos de dados a uma resolução máxima de 3,4 e 2,6 Å, respectivamente. Atendendo à elevada instabilidade da proteína utilizaram-se líquidos iónicos (IL) como estabilizadores e experiências de Ressonância Magnética Nuclear - Diferença de Transferência de Saturação (RMN-STD) permitiram identificar uma interacção específica entre a proteína e o anel imidazol do IL. A técnica de thermofluor também foi utilizada para determinar o tampão ideal para esta proteína. Novos ensaios de cristalização foram realizados com a chaperona em tampão Bis-Tris a pH 5,5 e a optimização dos cristais está em curso. De modo a estudar as interacções entre a chaperona PaoD e a PaoABC, recorreu-se à técnica SPR. Nos ensaios foi utilizada uma terceira proteína, a MocA, identificada como responsável pela formação do cofactor MCD (Molybdopterin cytosine dinucleotide). Os dados obtidos mostraram que esta, para além de interagir com a chaperona PaoD, interage também com a enzima PaoABC. Este resultado sugere a formação de um complexo PaoABC-PaoD-MocA e a sua presença in vivo pode estar relacionada com o aumento da eficácia do processo de expressão da enzima de molibdénio. A proteína YqeB, também foi cristalizada usando PEG ou isopropanol como agentes precipitantes. As condições de cristalização estão de momento a ser optimizadas de modo a obter cristais únicos passíveis de serem usados numa experiência de difracção que possibilite a determinação da sua estrutura. O processo de expressão e purificação da XdhC encontra-se em fase de optimização, de forma a ser possível obter proteína para a realização dos ensaios de cristalização