Interacção de proteínas com superfícies nanoestruturadas e nanopartículas de metais nobres

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Química Inorgânica pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e TecnologiaNa interface entre a Bioquímica e a Nanotecnologia surge a Bionanotecnologia, área científica relacionada com o estudo das aplicações de biomoléculas em dispositivos de base nanotecnológica, como por exemplo em biossensores para aplicação em diagnóstico clínico. Neste contexto, as interacções de proteínas com superfícies nanoestruturadas e nanopartículas de metais nobres, que constituem o objecto de estudo da presente tese, são especialmente importantes. De facto, do estudo da estrutura e função de proteínas em associação com tais nanoestruturas metálicas podem surgir pistas para a concepção racional de bio-nanosensores. A primeira parte deste trabalho consistiu no estudo espectroelectroquímico de citocromos c3 do Tipo II e do Tipo I, adsorvidos a monocamadas auto-montadas (SAM) de ácido mercaptoundecanóico ou de neoglicoconjugado de maltose à superfície de eléctrodos de prata, pela aplicação de Espectroscopia de Ressonância de Raman. A SAM de neoglicoconjugado de maltose permitiu a determinação dos potenciais de redução dos quatro hemos para as proteínas estudadas e demonstrou um melhor desempenho espectroelectroquímico comparativamente com a SAM de ácido mercaptoundecanóico para ambos os citocromos c3. Foi também estudada por Microscopia de Força Atómica (AFM), a imobilização da ferroquelatase recombinante de fígado de rato em SAM de alcanotióis com grupos terminais com diferentes funcionalidades, à superfície de ouro. O modo de adsorção da ferroquelatase à superfície de ouro foi dependente do tipo de SAM, ajudando a definir superfícies promissoras para o desenvolvimento de biossensores com elevada especificidade. Na segunda parte deste trabalho estudou-se a formação de bionanoconjugados constituídos por citocromo c de coração de cavalo (HCc) ou citocromo c de levedura (YCc) com nanopartículas de ouro (AuNP) revestidas com citrato de sódio. A formação dos bionanoconjugados foi comprovada pelo desvio para o vermelho da banda de ressonância plasmónica superficial (SPR), aumento do valor de potencial zeta e detecção de aumento de tamanho por AFM. Os bionanoconjugados formados apresentaram diferentes propriedades de superfície, que foram relacionadas com diferentes modos de ligação das proteínas às AuNP: através de uma ligação covalente pelo resíduo de cisteína 102 para YCc e através de interacções electrostáticas para HCc. Na perspectiva de melhorar a capacidade de adsorção da proteína à superfície das nanopartículas formaram-se bionanoconjugados com HCc e AuNP funcionalizadas com ácido mercaptoundecanóico (MUA). O modo de ligação electrostática parece ser mais eficaz entre os MUA e a proteína, relativamente à superfície de citrato, demonstrando que a funcionalização é uma estratégia eficaz para a obtenção de bionanoconjugados mais estáveis e robustos. Estudou-se ainda as alterações conformacionais das proteínas nos bionanoconjugados por Espectroscopia de UV-visível, que revelou padrões de protonação de superfície através dos diferentes valores para o pH de agregação; e Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) que demonstrou que o pH do meio determina a conformação da proteína no bionanoconjugado. A investigação das interacções entre proteínas e nanopartículas metálicas permite racionalizar a formação de bionanoconjugados com novas propriedades de superfície e potenciais aplicações em bioensaios e biossensores.Bolsa de doutoramento(SFRH/BD/18630/2004), co-financiada pelo Programa Operacional Ciência e Inovação 2010 e Fundo Social Europeu