Role of hypoxia and Hif pathway in vascular development in zebrafish

Das kardiovaskuläre System (KVS) besteht aus dem Herzen und den Blutgefäßen und bildet ein geschlossen zirkulierendes System. Nahezu alle Gewebe sind auf Nährstoffe und molekularen Sauerstoff (O2) angewiesen und beides wird durch das Blut geliefert, daher ist es nicht überraschend, dass das KVS das erste arbeitende System und das Herz das erste funktionelle Organ im sich entwickelnden Embryo sind (Baldwin 1996). Die Bausteine der Blutgefäße sind Endothelzellen (EZs), welche das Endothelium bilden, ein spezialisiertes Epithelium, welches die luminale Oberfläche der Gefäße definiert (Pugsley and Tabrizchi 2000). Der Prozess der Blutgefäßentwicklung beinhaltet verschiedene Schritte. Während des ersten Schritts, der Vaskulogenese, entstehen neue Gefäße, um die primäre vaskuläre Schlinge zu bilden. Während der Vaskulogenese, migrieren und verschmelzen die Gefäßvorläufer, die Angioblasten, um das axiale Gefäß zu bilden. Darauffolgend durchlaufen die Hauptgefäße einen spezifischen Schritt, bei welchem sie entweder eine arterielle oder venöse Identität erlangen. Wenn der Embryo an Größe zunimmt, muss die Hauptgefäßschlinge an Komplexität gewinnen. Um alle verschiedenen Teile der Organe zu erreichen, werden bei der sogenannten Angiogenese neue Blutgefäße aus bereits existierenden geformt (Gore et al. 2012). Reife Blutzellen weisen eine geringe Lebensspanne auf. Daher werden hämatopoetische Stammzellen (HSZs) während der gesamten Lebenszeit eines Organismus benötigt, um durch die Hämatopoese einen konstanten Nachschub an neuen Blutzellen zu garantieren. Interessanterweise wurde in verschiedenen Fällen gezeigt, dass EZ- und Immunzellentwicklung eng miteinander verknüpft sind, beispielsweise während der Entwicklungshämatopoese. Während der Embryogenese findet die definitive Hämatopoese im hämatogenen Endothelium (HE) statt, einer spezialisierten Unterform von EZs in der ventralen Wand der dorsalen Aorta (DA). HE besitzt hämatopoetisches Potential und bildet HSZs, durch einen Prozess der als Endothel-zu-Hämatopoese-Übergang (EHÜ) bezeichnet wird. Während dem EHÜ werden diese spezialisierten EZs von der DA ausgestoßen und anschließend in der sogenannte Aorta-Keimdrüsen-Urnieren-Region (AKU) kolonisiert, womit sie die nativen HSZs formen (Paik and Zon 2010). Da die Gefäßentwicklung verschiedene Schritte benötigt, sind viele molekulare Signalwege involviert. Es wurde demonstriert, dass der Notch-Signalweg einer der Hauptakteure in der Gefäßentwicklung ist. Unter anderem ist der Notch-Signalweg wichtig während dem EHÜ. Im Mausmodell wurde gezeigt dass Runx1, einer der Hauptregulatoren der HSZ-Bildung, durch NOTCH1 über die Aktivierung von GATA2 transkriptionell reguliert wird. Diese Beobachtung wurde später durch knockdown-Studien für notch1a und notch1b im Zebrafisch bestätigt (Butko, Pouget, and Traver 2016). Ein weiterer essentieller Signalweg für die Gefäßentwicklung ist der HIF-Signalweg. Hif-1β-, Hif-1α- und Hif-2α-Mausmutanten weisen schwerwiegende vaskuläre Defekte auf, welche in einer frühen Embryonensterblichkeit resultieren (Simon and Keith 2008), was eine tiefere Analyse der in den Mutantenembryos auftretenden Phänotypen behindert. Zusätzlich führte die Deletion von Hif-1a spezifisch in Myeloidzellen zu Unregelmäßigkeiten in der Motilität, sowie der Fähigkeit zur Invasion und Adhäsion von Makrophagen (Cramer et al. 2003). Faszinierenderweise führt die Deletion von Hif-1a in vaskulären, cadherinproduzierenden Endothelzellen zu einer signifikanten, aber partiellen Reduktion der HSZ-Anzahl, was zu der Vermutung führt, dass weitere Akteure in diesen Signalweg involviert sein könnten (Imanirad et al. 2014). Es wurde gezeigt, dass Zebrafischembryonen in sehr frühen Entwicklungsstadien tolerant gegenüber Hypoxie sind (Padilla and Roth 2001). Außerdem entwickeln sich Zebrafischembryonen extern, was es ermöglicht, dass die Umgebung, in welchem sie heranwachsen, manipuliert werden kann. (Lieschke and Currie 2007). Diese Eigenschaften machen den Zebrafisch zu einem idealen Modell, um zu studieren, wie Hypoxie und Hif-Transkriptionsfaktoren die Gefäßentwicklung von Wirbeltieren beeinflussen. In dieser Studie werde ich den Einfluss von Hypoxie auf die Gefäßentwicklung von Zebrafischen prüfen. Spezifisch werde ich die Rolle von hif-1α in der Interaktion von Makrophagen mit EZs während der Entwicklung und Reparatur von Gefäßen analysieren. Weiterhin zeige ich die redundanten Funktionen für hif-1α und hif-2α in der HSZ-Entwicklung stromaufwärts des Notch-Signalweges.The cardiovascular system (CVS) consists of heart and blood vessels, forming a close circulatory loop. All tissues depend on the nutrients and molecular oxygen (O2) delivered by the blood. Therefore, it is not surprising that the CVS is one of the first working systems and the heart is the first functional organ in the forming embryo (Baldwin 1996). The building blocks of blood vessels are endothelial cells (ECs), which form the endothelium, a specialized epithelium that defines the luminal surface of the vessels (Pugsley and Tabrizchi 2000). The process of blood vessel development comprises several steps. The first events occurring are the formation of new vessels de novo to constitute the primary vascular loop known as vasculogenesis. During vasculogenesis the vascular precursors, known as angioblasts, migrate and coalesce to form the axial vessels. Subsequently, the main vessels undergo a specification step where they acquire either arterial or venous identity. As the embryo increases in size, the main vascular loop needs to increase in complexity. In order to reach all the different parts of the developing organs, new blood vessels are formed from pre-existing ones, a phenomenon known as angiogenesis (Gore et al. 2012). Mature blood cells have a short lifespan. Therefore, hematopoietic stem cells (HSCs) are required throughout lifetime to constantly form new blood cells in a process called hematopoiesis. Interestingly, endothelial and immune cells development have been shown to converge at different points during their development, one of which is developmental hematopoiesis. During embryogenesis, definitive hematopoiesis occurs in a tissue called hemogenic endothelium (HE), a specialized subset of ECs at the ventral wall of the dorsal aorta (DA). HE acquires hematopoietic potentials and gives rise to HSCs, through a process known as endothelial-to-hematopoietic transition (EHT). During EHT, these specialized ECs extrude from DA and colonize the so-called aorta-gonadmesonephros (AGM) region, forming the native HSCs (Paik and Zon 2010). As vascular development requires different steps, the molecular pathways involved are many. The Notch signaling pathway has been demonstrated to be one of the main players in vascular development. Among other functions, Notch signaling has been shown to be important during EHT. In the murine model, Runx1, a master regulator of HSC formation, has been shown to be transcriptionally regulated by NOTCH1 through GATA2 activation. This observation was later corroborated by knockdown studies for notch1a and notch1b in zebrafish (Butko, Pouget, and Traver 2016). Another essential pathway for vascular development is the HIF pathway. Hif-1α, Hif-1β and Hif-2α mouse mutants show severe vascular defects that result in early embryonic lethality (Simon and Keith 2008), which hinders a deep analysis of the phenotypes incurring in the mutant embryos. In addition, deletion of Hif-1α specifically in myeloid cells showed abnormalities in the motility, invasiveness, and adhesion of macrophages (Cramer et al. 2003). Intriguingly, Hif-1α deletion in vascular endothelial cadherin-expressing cells led to a significant but partial reduction of HSC number, suggesting that other players may be involved in this pathway (Imanirad et al. 2014). Zebrafish embryos have been shown to be tolerant to hypoxia at very early stages of development (Padilla and Roth 2001). Also, zebrafish embryos develop externally and this allows to finely manipulate the environment where they grow (Lieschke and Currie 2007). These features make zebrafish an ideal model to investigate how hypoxia and Hif transcription factors affect vertebrate vascular development. In this study, I will examine the impact of hypoxia on zebrafish vascular development. Specifically, I will dissect the role of hif-1α in macrophage-EC interactions during vascular development and repair. Moreover, I show redundant functions for hif-1α and hif-2α in HSC development upstream of Notch signaling