Hunajan botaanisen alkuperän määrittäminen hiilihydraattiprofiilin avulla

Hunaja on mehiläisten kukista tai hyönteisten eritteistä keräämästä medestä valmistamaa viskoosia ravintoliuosta. Elintarvikekäyttöön hunaja kerätään kennoissa mehiläispesistä, minkä jälkeen se lingotaan ja purkitetaan. Hunaja koostuu pääasiassa hiilihydraateista ja vedestä, mutta se sisältää myös pienissä pitoisuuksissa paljon muita yhdisteitä kuten proteiineja, vitamiineja, orgaanisia happoja ja fenolisia yhdisteitä. Suurin osa hunaja hiilihydraateista on fruktoosia ja glukoosia, mutta näiden lisäksi mukana on huomattavasti pienempinä pitoisuuksina lukuisia di-, tri- ja oligosakkarideja. Hunajan koostumus ja sitä kautta hiilihydraattiprofiili voivat vaihdella merkittävästi riippuen alkuperäkasvilajista, maaperästä, ilmastosta ja muista kasvuolosuhteista. Tutkimuksen tavoitteena oli kehittää pulssiamperometriseen detektioon yhdistetty anioninvaihtokromatografiamenetelmä (HPAEC-PAD-menetelmä), jonka avulla voitiin määrittää hiili¬hydraatti¬profiilit näytteenä olleille kotimaisille laji- ja sekahunajille. Lisäksi pyrittiin tutkimaan eri kasvi¬tieteellistä (botaanista) alkuperää olleiden hunajien hiilihydraattiprofiilien välisiä eroja pääkomponentti¬analyysin (PCA) avulla. Työssä käytetty laitteisto koostui kromatografisesta erotusmoduulista, elektrokemiallisesta detektorista sekä Dionex CarboPac PA1 -kolonnista. Ajoliuoksina käytettiin Milli-Q-vettä, 100 mM natriumhydroksidi¬liuosta sekä 100 mM natriumhydroksidiliuosta, jossa oli mukana 0,5 M natriumasetaattipuskuria. Näytteinä toimi 33 kotimaista laji- ja sekahunajaa, jotka olivat 12:ta eri botaanista alkuperää. Näytteitä punnittiin kolmena rinnakkaisnäytteenä n. 0,5 g 50 ml:n mittapulloihin ja pullot täytettiin merkkiin Milli-Q -vedellä. Tästä liuoksesta tehtiin Milli-Q-veteen 1:5- ja 1:200-laimennokset, jotka suodatettiin 0,45 µm:n PVDF-suodattimen läpi ajopulloihin ennen analyysiä. Näytteissä olleet hiilihydraatit tunnistettiin 16:tta eri hiili¬hydraattia sisältäneen standardiseoksen avulla. Hiilihydraattien kvantitointi tapahtui kromatogrammeista saatujen piikkien korkeuksien avulla. Näytteistä pystyttiin erottamaan 10 eri hiilihydraattia hiilihydraattiprofiilin määrittämistä varten. Suurin osa näytteistä sisälsi fusitolia, fukoosia, glukoosia, fruktoosia, turanoosia, nigeroosia ja maltoosia. Osa näytteistä sisälsi myös trehaloosia ja ramnoosia. Vain yksi mesikastehunajanäyte sisälsi raffinoosia. Lisäksi suurin osa näytteistä sisälsi myös meletsitoosia/isomaltoosia, kojibioosia/1-kestoosia sekä β-gentiobioosia, mutta näiden hiilihydraattien kvantitointi ei ollut mahdollista yhdisteiden huonon resoluution vuoksi. Kvantitoitujen hiilihydraattien pitoisuudet vaihtelivat paljon jopa samaa lajihunajaa olleiden näytteiden välillä. PCA:n perusteella mesikastehunaja erosi selvästi muista lajihunajista. Luotu PCA-malli selitti n. 64 % koko aineiston varianssista. Toisessa PCA-mallissa, josta oli poistettu eronneet mesikastenäytteet, etenkin jättipalsami-, horsma- ja hillahunajat pystyttiin erottamaan muista lajihunajista omiksi ryhmikseen. Tämä malli selitti n. 40 % koko aineiston varianssista. Suuri osa eri lajihunajista muodosti kuitenkin molemmissa malleissa joukon, josta ei pystytty löytämään selkeitä eroja siihen kuuluneiden lajihunajien välillä. Lisäksi muutaman näytteen kohdalla heräsi kysymys näytteen todellisesta botaanisesta alkuperästä. Kehitetty menetelmä soveltui erityisesti mesikastehunajan erottamiseen muista tutkituista lajihunajista. Muiden lajihunajien väliset erot eivät olleet aivan yhtä selkeitä, vaikka osa näistä lajihunajista osoitti merkkejä yksilöllisestä hiilihydraattiprofiilista. Tutkimuksessa käytetty näytemäärä oli toisaalta melko pieni. Tämän vuoksi saatujen tulosten perusteella ei voitu vielä tehdä vahvoja johtopäätöksiä eri lajihunajien hiilihydraattiprofiilien välisistä eroista. Jatkotutkimus suuremmalla näytteiden lukumäärällä on tarpeen, jotta tutkimuksessa löydetyt erot voidaan varmentaa.Honey is viscose nutrient solution which is produced by honey bees from the nectar of the plants or excretions of plant sucking insects. For food use honey is collected from beehives in honeycombs which are centrifuged and the separated solution is canned. Honey consists mainly of carbohydrates and water but there are also in small amounts numerous other compounds such as proteins, vitamins, organic acids and phenolic compounds. Most of the carbohydrates in honey are fructose and glucose but also a great number of di-, tri-, and oligosaccharides can be found in smaller amounts. Composition of honey and therefore the carbohydrate profile can vary greatly depending on the honeys botanical origin, soil, climate and other factors affecting the growing environment. The goal of this study was to develop a chromatographic method using high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) to determine carbohydrate profiles for domestic unifloral and mixed honeys. Principal component analysis (PCA) was used to investigate the differences in determined carbohydrate profiles. Equipment used in this study consisted of chromatographic separations module, electrochemical detector and Dionex CarboPac PA1 column. Milli-Q water, 100 mM sodium hydroxide solution and 100 mM sodium hydroxide solution with 0,5 M sodium acetate buffer were used as eluents. 33 domestic unifloral and mixed honeys of 12 different botanical origins were used as samples. Approximately 0,5 g of samples were weighed in three replicates to 50 ml volumetric flasks which were filled with Milli-Q water. From these solutions 1:5 and 1:200 dilutions were made and they were filtered to HPLC vials through 0,45 µm PVDF-filter before analysis. Carbohydrates in samples were identified using a standard mixture with 16 carbohydrate standards. Carbohydrates were quantified from chromatograms using the height of detected peaks. Ten different carbohydrates could be separated from the honey samples for determination of carbohydrate profiles. Most of the samples contained fucitol, fucose, glucose, fructose, turanose, nigerose and maltose. Some samples contained also trehalose and rhamnose. Raffinose was quantitated from one honeydew sample. In addition melezitose/isomaltose, kojibiose/1-kestose and β-gentiobiose were detected in samples but quantitation of these carbohydrates could not be done because of poor resolution. Concentrations of the quantitated carbohydrates varied greatly even between honey samples of same botanical origin. PCA revealed that honeydew honeys differed clearly from other unifloral honeys according to their carbohydrate profiles. The PCA model explained circa 64 % of variance in the whole dataset. Differed honeydew samples were removed from second PCA model. In this model Himalayan Balsam, cloudberry and willowherb honeys could be separated as individual groups from the other unifloral honeys. This model explained circa 40 % of variance in the whole dataset. However in PCA most of the unifloral honeys formed a group where no clear differences could be assessed between samples of different botanical origin. Moreover some samples aroused a suspicion over their actual botanical origin. The developed method could be used to separate honeydew honey samples from blossom honey samples. The differences among other unifloral honey samples were not clear although some of the unifloral honeys showed some signs of unique carbohydrate profile. On the other hand the number of samples used in this study was quite small. Therefore strong conclusions about the differences among carbohydrate profiles of different unifloral honeys could not be made. For future research greater number of samples is required in order to verify the potential differences found in this study