Expression, Function, and Regulation of the K-Cl Cotransporter KCC2 isoforms in the Central Nervous System

The potassium-chloride cotransporter KCC2 is a key regulator of chloride homeostasis in neurons of the central nervous system (CNS) and it is critical for the development of fast hyperpolarizing synaptic inhibition. Two full-length isoforms of KCC2, KCC2a and KCC2b, differing by their amino termini have been described. Both isoforms have similar expression levels in neonatal mice, but KCC2b is strongly upregulated in cortical areas during postnatal development, resulting in a developmental shift of GABAergic responses. In contrast to the well-studied KCC2b isoform, the importance of the KCC2a isoform has not yet been demonstrated. My thesis work focuses on characterizing the transcriptional regulation, expression and function of the KCC2 isoforms and a central aim is to elucidate the isoform-specific differences. The molecular mechanisms underlying the regulation of KCC2 gene expression are not yet well understood. Both isoforms show a largely neuron-specific expression pattern and their expression is tightly regulated in development. The KCC2b isoform is also known to be regulated by both normal and pathological neuronal activity. One aim of the present thesis work was to explore the functionality of a conserved E-box site in the KCC2b promoter. Results suggest that the E-box site functions as a binding site for the upstream stimulating factors 1 and 2 (USF1, USF2), two basic helix-loop-helix transcription factors with potentially important roles in brain. Binding of USF proteins to the E-box motif contributes to the upregulation of KCC2b gene expression in immature cortical neurons. Another aim of this study was to compare the postnatal expression patterns of KCC2a and KCC2b proteins in various regions of mouse CNS using immunohistochemistry and isoform-specific antibodies. The cellular expression patterns of KCC2a and KCC2b were largely similar in developing and neonatal mouse. In mature brain, KCC2a is detected in the basal forebrain, hypothalamus, and many areas of the brainstem and spinal cord, but its expression is very low in cortical regions. At the subcellular level, immunoreactivities of the isoforms are only partially colocalized, and KCC2a immunoreactivity, in contrast to KCC2b, is not clearly detected at the neuronal soma surface in most brain areas. Biotinylation experiments suggest that the N-terminal KCC2a epitope might be masked. Results of this thesis work also indicate that the KCC2a isoform, similar to KCC2b, can function as a chloride transporter and decrease the intracellular chloride concentration in cultured neurons. The unique N-terminus of KCC2a includes a SPAK kinase binding site, and the importance of this site and the WNK-SPAK signaling pathway is also explored. Our results indicate that the SPAK kinase is able to bind the KCC2a isoform and to regulate the transport activity of KCC2a more than that of KCC2b.Keskushermostossa esiintyvä kloridinkuljetusproteiini KCC2 on keskinen hermosolujen kloridi-homeostaasin säätelijä, ja sen toiminta on välttämätöntä hyperpolarisoivan inhibition toiminnalle. KCC2:sta tunnetaan kaksi täyspitkää isoformia, KCC2a ja KCC2b, jotka eroavat toisistaan aminoterminaalisen pään osalta. Molempien proteiinimuotojen ilmentyminen vastasyntyneillä hiirillä on saman tasoista, mutta KCC2b:n ilmentymisen taso kasvaa voimakkaasti kortikaalisilla aivoalueilla postnataalisen kehityksen aikana, ja sen seurauksena tapahtuu GABAA reseptori-vasteen muutos depolaroivasta hyperpolaroivaksi. KCC2b isoformia on tutkittu verrattain paljon, mutta KCC2a muodon merkitys on sen sijaan vielä tuntematon. Tässä väitöskirjatyössä olen selvittänyt KCC2 isoformien transkription säätelyä, ilmentymistä ja toimintaa, tavoitteena erityisesti selvittää isoformien välisiä eroavaisuuksia. KCC2 geenin ilmentymiseen liittyvät molekyylitason mekanismit tunnetaan vielä varsin huonosti. Molemmat isoformit ilmentyvät pääasiallisesti hermosoluissa, ja ilmentyminen on tarkasti säädeltyä kehityksen aikana. KCC2b isoformin ilmentymisestä tiedetään myös, että siihen vaikuttaa niin hermosolujen normaali kuin patologinenkin aktiivisuus. Yksi tämän tutkimuksen tavoitteista oli selvittää KCC2b:n promoottorialueella sijaitsevan E-box DNA-elementin merkitystä. Tulokset viittaavat siihen, että E-box toimii sitoutumiskohtana USF1 ja USF2 (upstream stimulating factors 1 and 2) transkriptiotekijöille. USF transkriptiotekijät kuuluvat basic helix-loop-helix –perheeseen, ja niillä on osoitettu olevan tärkeä tehtävä aivoissa. Tulosten perusteella USF proteiinit vaikuttavat aktivoivasti KCC2b geenin ilmentymisen epäkypsissä kortikaalisissa hermosoluissa. Toinen tutkimuksen tavoitteista oli verrata KCC2a ja KCC2b proteiinien postnataalista ilmentymistä solutasolla hiiren keskushermoston eri alueilla immunohistokemian menetelmin. Tulosten perusteella KCC2a ja KCC2b isoformit ilmentyvät hiirillä pääosin samoilla keskushermoston alueilla varhaisen kehityksen aikana. Aikuisilla hiirillä KCC2a muotoa havaittiin lähinnä etuaivon basaaliosassa sekä hypotalamuksen, aivorungon ja selkäytimen alueilla, mutta ilmentyminen iso- ja pikkuaivojen kortikaalisilla alueilla oli hyvin vähäistä. Lisäksi immunovärjäyksissä havaittiin, että isoformien subsellulaarinen lokalisaatio ei ollut täysin päällekkäinen hermosoluissa, ja KCC2a muoto ei myöskään tyypillisesti näkynyt soomaosien solukalvolla. Biotinylaatiokokeiden perusteella KCC2a isoformi kuitenkin sijaitsee myös solukalvolla viitaten siihen, että KCC2a muodon aminoterminaalinen epitooppi olisi piilossa. Tämän työn tulokset osoittavat myös, että KCC2a isoformi voi toimia kloridinkuljetuksessa KCCC2b isoformin tavoin, ja se pystyy alentamaan solunsisäistä kloriditasoa viljellyissä hermosoluissa. KCC2a isoformin aminoterminaalisessa osassa on sitoutumiskohta SPAK-kinaasille (mikä puuttuu KCC2b isoformista). Tulosten perusteella SPAK kinaasi pystyy sitoutumaan KCC2a isoformiin, ja näyttäisi säätelevän enemmän KCC2a- kuin KCC2b-muodon aktiivisuutta