Estudio de la regulación global del sistema CbrAB en Pseudomonas putida y búsqueda de secuencias consenso de unión al ADN

Resumen del trabajo presentado a la XI Reunión del Grupo de Microbiología Molecular, celebrada en Sevilla del 6 al 8 de septiembre de 2016.El sistema CbrAB es un sistema de regulación global exclusivo del género Pseudomonas que parece responder a cambios de disponibilidad de nutrientes en el medio ambiente. Los análisis de microarrays en Pseudomonas putida realizados en el laboratorio permitieron determinar que CbrAB participa en procesos tan diversos como en el transporte y utilización de aminoácidos como fuente de carbono, tolerancia a metales pesados, movilidad bacteriana o represión catabólica. El elemento regulador del sistema, CbrB, consta de tres dominios: un dominio receptor, un dominio central con actividad ATPasa y dominio de unión a DNA. Para identificar las dianas a las que CbrB reconoce de forma directa, se realizó un ensayo de ChIP-Seq, que ha permitido identificar regiones promotoras de distintos genes a las que se une CbrB para controlar su expresión. Además se pretende encontrar patrones comunes en estas regiones para definir una secuencia consenso de unión de CbrB. Las regiones promotoras de algunos de los genes diana identificados presentaron tres secuencias repetidas de 6 pb (F1 en orientación directa, y R1 y R2 en orientación inversa), que podrían constituir un elemento común a todos ellos. Para comprobar la relevancia de estas secuencias en la activación transcripcional por CbrB de estos genes, se realizaron fusiones transcripcionales de las regiones promotoras al gen lacZ, y se analizó la expresión como medida de la actividad β-galactosidasa en distintas condiciones de activación del sistema. También se estudió la activación cuando la región promotora contenía sustituciones en los posibles subsitios de unión F1, R1 y R2. Además se estudió la unión de CbrB a la región promotora del operón diana PP2810-13 mediante ensayos de retardo en gel (EMSA), y a la que contenía los sitios de unión de CbrB mutados. El operón PP2810-13 codifica una posible bomba de extrusión tipo RND. Con el objeto de dilucidar su función y la relación con los procesos en los que interviene el sistema CbrAB, se ha construido un mutante de inserción en el gen PP2812 y se ha realizado una caracterización fenotípica del mismo.Peer Reviewe