Efeito citotóxico do sulforafano em células de osteossarcoma humano

Mestrado em Biologia AplicadaO osteossarcoma é o tipo mais comum de tumor maligno do osso. Esta doença apresenta uma elevada incidência em crianças e adolescentes. Adicionalmente, metástases, ocorrendo principalmente nos pulmões, afectam uma percentagem considerável dos pacientes com osteossarcoma. Os tratamentos actuais incluem ressecção cirúrgica, quimioterapia e radioterapia, mas os pacientes com osteossarcoma apresentam uma baixa capacidade de resposta a estas opções de tratamento. Assim, é urgente desenvolver novas abordagens de tratamento. O sulforafano é um fitocomposto que exibe actividade quimiopreventiva e quimioterápica. Numerosos estudos têm demonstrado que o sulforafano modula muitos eventos associados ao cancro, como susceptibilidade a agentes carcinogénicos, ciclo celular, apoptose, angiogénese e metastização. Apesar de bem caracterizados em diversos tumores, os efeitos do sulforafano são ainda insuficientemente conhecidos no osteossarcoma, assim como o mecanismo de acção subjacente. O objectivo desta dissertação foi avaliar os potenciais efeitos citostático e apoptótico do sulforafano e revelar o mecanismo de acção por trás destes efeitos. Para isso, a linha celular de osteossarcoma humano MG-63 foi exposta a sulforafano (no intervalo de 0 a 20 μM) durante 24 e 48 h. Parâmetros como confluência, morfologia celular, viabilidade celular, ciclo celular, clastogenicidade, apoptose, actividade específica de caspases e expressão de genes associados ao ciclo celular foram analisados após o tratamento com sulforafano. As culturas expostas ao sulforafano apresentaram uma diminuição da confluência, acompanhada de alterações na morfologia celular. O sulforafano também induziu uma diminuição da viabilidade celular dependente da dose e do tempo de exposição que pode ser explicada pelo aumento de células apoptóticas e por citostaticidade com bloqueio na fase G2/M. Este bloqueio do ciclo celular foi mediado por Chk2, pela sub-expressão de CDC25C e, provavelmente, pela sub-expressão de CCNB1, assim como de CDK2. Um efeito clastogénico foi também detectado após 48 h de tratamento com sulforafano. Estes dados sugerem que o sulforafano deve ser considerado um candidato a agente quimioterápico no tratamento de osteossarcoma, embora sejam necessários mais estudos para lançar luz sobre vias de sinalização moduladas pelo sulforafano, assim como sobre a possível citotoxicidade deste fitocomposto em osteoblastos normais.Osteosarcoma is the most common type of malignant bone tumor. This disease shows high incidence in children and adolescents. Additionally, metastases occurring mainly at the lungs affect a considerable percentage of osteosarcoma patients. Current treatments include surgical resection, chemotherapy, and radiotherapy, but osteosarcoma patients show poor responsiveness to these treatment options. Thus, it is urgent to develop novel treatment approaches. Sulforaphane is a phytochemical that displays chemopreventive and chemotherapeutic activity. Many studies have been shown that sulforaphane modulates many cancer-related events, as susceptibility to carcinogenic agents, cell cycle, apoptosis, angiogenesis, and metastasis. Although well characterized in several tumors, the effects of sulforaphane are still poorly understood in osteosarcoma, as well as the underlying mechanism of action. The aim of this dissertation was to evaluate the potential cytostatic and apoptotic effects of sulforaphane and to unveil the mechanism of action behind these effects. In order to do that, the human osteosarcoma cell line MG-63 was exposed to sulforaphane (in the 0 to 20 μM range) for 24 and 48 h. Parameters as confluence, cell morphology, cell viability, cell cycle, clastogenicity, apoptosis, caspase specific activity, and expression of cell cycle-related genes were analyzed after sulforaphane treatment. Cultures exposed to sulforaphane showed a decrease in confluence, accompanied by alterations in cell morphology. Sulforaphane also induced a dose- and time-dependent impairment of cell viability, which can be explained by an increase of apoptotic cells and cytostaticity with G2/M phase arrest. This cell cycle blockage was mediated by Chk2 and CDC25C downregulation, and probably CCNB1 as well as CDK2 downregulation. A clastogenic effect was also detected after 48 h of sulforaphane treatment. These data suggest that sulforaphane should be considered as a chemotherapeutic agent candidate in osteosarcoma treatment, although more studies are needed to shed insight on signaling pathways modulated by sulforaphane, as well as the possible cytotoxicity of this phytochemical on normal osteoblasts