Indução de stress oxidativo pelo sulfurafano em osteosarcoma humano

Mestrado em Biologia Aplicada - Microbiologia Clínica e AmbientalO sulforafano (SFN) é um composto que pertence à família dos isotiocianatos, sendo o mais estudado deste grupo, principalmente pelas suas potenciais propriedades anti-tumorais. Existe em grande quantidade nas crucíferas, sobretudo nos brócolos. Vários estudos têm demonstrado a capacidade do SFN em causar paragem do ciclo celular, indução da apoptose, aumento de espécies reactivas de oxigénio (ROS), no entanto, os seus efeitos no osteosarcoma, estão ainda pouco compreendidos, principalmente ao nível do stress oxidativo. O objectivo deste estudo foi investigar a capacidade do SFN induzir, in vitro, stress oxidativo numa linha celular de osteossarcoma humano, a MG-63, e compreender as vias de stress oxidativo envolvidas neste processo. Para tal, as células MG-63 foram expostas a diferentes concentrações de SFN (0, 5, 10 e 20μM) em diferentes períodos (24 e 48h). O crescimento e a morfologia celular foram observados através do microscópio invertido e a viabilidade celular determinada usando o ensaio de Trypan Blue. A avaliação do stress oxidativo foi realizada através da análise da actividade das enzimas envolvidas na destoxificação de espécies reativas de oxigénio (ROS), nomeadamente glutationa peroxidase, glutationa reductase e superóxido dismutase. A actividade antioxidante total, a glutationa reduzida e a peroxidação lipídica foram também analisadas, bem como a expressão de genes relacionados com o stress oxidativo (SOD1, SOD2, GSR, GPX1, GSTM1 e GSTM4 e CAT). Os ensaios enzimáticos, bem como a actividade antioxidante total, foram avaliadas por diferentes ensaios colorimétricos no leitor de microplacas, já a glutationa reduzida e a peroxidação lipídica foram avaliadas por fluorimetria. Observou-se para ambos os períodos de exposição que a maior concentração de SFN reduziu a viabilidade celular, relativamente ao controlo, bem como a actividade de todas as enzimas analisadas. A actividade antioxidante total aumenta com o tempo e diminui com a concentração de SFN. A actividade das enzimas decresce com o aumento da concentração de SFN (e com o tempo para concentrações de SFN elevadas). Verificou-se também um aumento da glutationa reduzida para concentrações de SFN baixas, embora tenha decrescido para valores de SFN mais elevadas. A expressão dos genes é concordante em geral com a actividade das respectivas enzimas, ou seja diminui com o aumento da concentração. No entanto é observada uma excepção para a SOD em que a actividade diminui com a concentração enquanto a expressão aumenta. Pode-se observar que a peroxidação lipídica diminui com a concentração. Como conclusão, estes resultados indicam que o SFN induz stress oxidativo em células de osteossarcoma humano. Propõe-se um modelo de acção para o stress oxidativo induzido por SFN em osteossarcoma.Sulforaphane (SFN) is a compound that belongs to the isothiocyanates family and is the most studied compound of this group, mostly due to its putative anti-tumoral properties. It is found in large quantities in cruciferous vegetables, mainly broccoli. Several studies have shown the ability of SFN to cause cell cycle arrest, apoptosis induction, reactive oxygen species (ROS) formation however, its effects in osteosarcoma, is still poorly understood, mostly at the stress oxidative level. The aim of this study was to investigate the ability of SFN in inducing, in vitro, oxidative stress in the human osteosarcoma cell line MG-63. It was also an aim to understand the pathways of oxidative stress involved in this process. For these propose, MG-63 cells were exposed to different concentrations of SFN (0, 5, 10 and 20μM) at different times (24 and 48h). The growth and cell morphology were observed through an inverted microscope, and cell viability determined using Trypan Blue assay. The oxidative stress evaluation was performed by the activity analysis of antioxidant enzymes, namely, glutathione peroxidase, superoxide dismutase and glutathione reductase. The total antioxidant activity (TAA), reduced glutathione and lipid peroxidation were also analysed, as well as the expression of genes related to oxidative stress (SOD1, SOD2, GSR, GPX1, GSTM1 and GSTM4 and CAT). Enzyme assays and total antioxidant activity were evaluated by different colorimetric assays on a microplate reader, while the reduced glutathione and lipid peroxidation were evaluated by fluorimetry. It was observed (for both exposure periods) that the highest concentration of SFN reduced cell viability relatively to control, and reduced the activity of all tested enzymes. The total antioxidant activity increased with time and decreased with the concentration of SFN. The activity of enzymes decreased with the increasing concentration of SFN (and with time for the highest SFN concentrations). There was also an increase of the reduced glutathione for low SFN concentrations, while it decreased for higher concentrations of SFN. Overall, the gene expression is consistent with the corresponding enzymes activities, i.e., the expression decreased with increasing concentrations of SFN. However, SOD was an exception (SOD activity decreased with SFN concentration whereas its expression increased). It can be observed that lipid peroxidation declined with SFN concentration increase. Finally, these results indicate that SFN induces oxidative stress in human osteosarcoma cells. It is proposed a model for the pathways involved in this oxidative stress–induced by SFN in osteosarcoma