PPA e a sua fosforilação na sinalização STAT3 induzida por Gα0

Mestrado em Biomedicina MolecularA proteína precursora de amilóide de Alzheimer (PPA) é uma proteína cerebral fundamental, envolvida em mecanismos celulares como a adesão e migração celular e neuritogénese. Como fosfoproteína, a PPA apresenta oito resíduos fosforiláveis no seu domínio citoplasmático. Um desses resíduos, Serina 655 (S655), localiza-se no motivo funcional 653YTSI656, e a sua fosforilação altera o tráfego e o processamento da PPA, podendo ainda mediar a ligação desta a outras proteínas através de um hydrophobic pocket localizado imediatamente a jusante ao motivo YTSI (657His-Lys676). Nomeadamente, a proteína Gαo, uma subunidade α de proteínas G heterotrimérica, liga-se à PPA neste local. A Gαo está envolvida em várias cascatas de sinalização e é o membro da família Gi/o mais abundante no cérebro. Quando ativada, a Gαo consegue induzir fatores de crescimento relacionados com a via JAK2/STAT3 via Rap, provavelmente através da interação e sequestro de proteínas RapGAP. Adicionalmente, a Gαo foi sugerida como um transdutor da PPA, funcionando esta como um guanidine exchange factor (GEF) para a Gαo. No entanto, ainda não foi atribuído nenhum papel funcional a esta interação. O presente trabalho teve como principal objetivo determinar o papel da PPA na cascata de sinalização da STAT3 induzida por Gαo, pela análise dos efeitos da co-transfecção de PPA-Gαo nos níveis de STAT3 e STAT3 fosforilada através de Western blot. Para isto, células humanas de neuroblastoma SH-SY5Y são co-transfectadas por 6h e 24h com PPA-GFP cDNAs (Wt ou fosfomutantes S655: S655A, SA, e S655E, SE) e Gαo ou GαoCA (um mutante Q205L que mimetiza um estado constitutivamente activo da Gαo). Adicionalmente, foi estudado como é que os metabolismo da PPA e da Gαo afetam-se um ao outro, através da quantificação dos níveis de Gαo, PPA e PPAs secretada por Western blot. Em geral, os resultados obtidos mostram que as co-expressões de PPA-GFPs com Gαo/GαoCA levam a um decréscimo da fosforilação da STAT3 induzida por Gαo. Isto parece ocorrer através da indução de um efeito retro-inibitório nas vias Gαo-STAT3 após a ativação inicial da Gαo e, enquanto este efeito é mais pronunciado para o mutante que reproduz desfosforilação do resíduo S655 da PPA, a fosforilação neste mesmo resíduo parece retardar este efeito. Em concordância, a PPA invariavelmente diminui os níveis de Gαo e a Gαo também diminui os níveis de PPA, potencialmente envolvendo um mecanismo de inibição da ativação da STAT3 induzida pela Gαo através da PPA por degradação lisossomal PPA/Gαo.The transmembranar Alzheimer’s Amyloid Precursor Protein (APP), an important brain protein, is potentially involved in cellular mechanisms such as cell adhesion, migration and neuritogenesis. As a phosphoprotein, APP has eigth phosphorylatable residues in its cytoplasmic domain. One of these residues, S655, lies within the APP 653YTSI656 sorting motif, and its phosphorylation alters APP trafficking and processing, and may potentially mediate its binding to other proteins by means of a hydrophobic pocket localized immediately downstream the YTSI motif (657His-Lys676). This is the pocket to which Gαo, an alpha subunit of heterotrimeric G proteins, binds to. Gαo mediates various signaling pathways and is the most brain-enriched member of the Gαi/o family. When activated, Gαo can induce the growth factorsrelated JAK2/STAT3 pathway via Rap, probably through interaction and sequestration of RapGAP proteins. Gαo has been suggested to be a transducer of APP, with APP acting as a guanidine exchange factor (GEF) for Gαo. Nonetheless, no functional role has been attributed to this interaction. In the work here described, the role of APP in Gαo-induced STAT3 signaling was assayed, by analysing the effects of APP-Gαo co-transfection in STAT3 and phospho-STAT3 levels by Western blot means. For this, human SH-SY5Y neuroblastoma cells were co-transfected for 6h and 24h, with APP-GFP fusion cDNAs (Wt or S655 phosphomutants: dephosphomimicking S655A and phosphomimicking S655E) and Gαo or GαoCA (a Q205L mutant mimicking constitutively active Gαo). Additionally, the effects of APP and Gαo in each other metabolism were also evaluated, by quantifying the levels of Gαo, APP and medium secreted sAPP by Western blot analysis. In general, the results obtained show that APP-GFPs co-expression with Gαo/GαoCA leads to a decrease in Gαo-induced STAT3 phosphorylation. This appears to occur via a retro-inhibition effect on the Gαo-STAT3 pathways following an initial Gαo activation and, while is more pronounced for the S655 dephosphomimicking mutant, phosphorylation at S655 appears to delay this effect. Accordingly, APP invariably decreases Gαo half-life, and Gαo also decreases APP levels, with APP/Gαo lysosomal co-degradation being a potential mechanism by which APP inhibits Gαo-induced STAT3 activation